Radioimmunoassay

Radioimunoanalýza (RIA) neboli radioimunologická stanovení zahrnují takové metody radioizotopové mikroanalýzy, jejichž základem je imunochemická reakce antigenu se specifickou protilátkou (Ab), prováděná in vitro v přítomnosti vhodné radioaktivně značené sloučeniny jako radioindikátoru, který umožňuje kvantifikaci stanovení na základě určení distribuce aktivity.

Historie
Metoda, pomocí které byla poprvé změřena hladina inzulinu v krvi in vitro, byla vyvinuta v 50. letech 20. století v USA. Jednalo se vůbec o první kvantitativní stanovení hladiny hormonu v krvi. Za tento objev obdržela Rosalyn Sussman Yalow v roce 1977 Nobelovu cenu za medicínu. Tím, že bylo možné přesně změřit hladinu inzulinu v krvi, se léčba diabetu mellites posunula o výrazný kus dopředu.

Princip metody
Jedná se o kompetitivní imunoreakci, tzn. značený antigen soupeří o vazebná místa na protilátce, která se v reakční směsi nachází v omezeném množství, s neznačeným antigenem. Stanovovaná látka je v tomto případě neznačený antigen, další antigen je značen např. radioaktivním izotopem iodu (125I,131I) pro proteinové antigeny, či tritiem nebo 14C pro nízkomolekulární látky. Výsledkem reakce je vznik dvou komplexů: značený antigen-protilátka (Ag*-Ab) a neznačený antigen-protilátka (Ag-Ab). Množství značeného komplexu (Ag*-Ab) je nepřímo úměrné množství stanovovaného antigenu, čili čím více stanovované látky se ve vzorku nachází, tím menší množství značeného komplexu vznikne a tím menší bude výsledný signál. Toto si lze jednoduše vysvětlit tím, že značené antigeny se nenavážou na protilátku pro nedostatek vazebných míst, která obsadí neznačený antigen. Z uvedených poznatků také vyplývá, že se v reakční směsi nacházejí i volné formy Ag a Ag*. Celková reaktivita (T) se tak rozdělí do dvou frakcí – vázané (B) a volné (F), přičemž platí: T = B + F.

Postup metody
Pro kvantitativní stanovení určité látky ve vyšetřovaném vzorku je třeba vytvořit kalibrační křivku, která odráží závislost výsledného signálu na známé koncentraci dané látky. Kalibrační křivku připravujeme z tzv. standardů. Nedílnou součástí stanovení jsou i kontroly, kde předem známe velikost radioaktivity.

Solid-phase RIA (ve zkumavkách)
 * 1) Do zkumavek potažených specifickou protilátkou napipetujeme jednotlivé standardy a neznámé vzorky. Kontroly napipetujeme do nepotahovaných zkumavek.
 * 2) Do každé zkumavky přidáme ve stejném množství radioindikátor (Ag*).
 * 3) Promícháme a necháme inkubovat.
 * 4) Po dostatečně dlouhé době odsajeme reakční směs.
 * 5) Měříme vázanou (B) a volnou (F) radioaktivitu na gamačítači.

Pozn.: Separaci imunokomplexu lze provést i jinými způsoby, např. pomocí elektroforézy, ionexové chromatografie atd.

=== Příklady využití RIA v praxi ===


 * endokrinologie (hladiny hormonů) v krvi
 * digitoxin nebo digoxin u pacientů, kteří berou tyto léky
 * toxikologie: průkaz přítomnosti drog
 * krevní transfuze: přítomnost povrchového antigenu hepatitidy B (HBsAg) v darované krvi
 * imunologie: anti-DNA protilátky u systémového lupus erythematosus (SLE).

Výhody a nevýhody RIA
Hlavními výhodami této metody jsou vysoká citlivost a možnost automatizace. Nevýhodou je nutnost separačního mezistupně, dále nákladné zařízení nutné pro provádění této metody a v neposlední řadě rizika spojená s manipulací s radioaktivní látkou.

Related articles

 * ELISA