Alkaline phosphatase

Alkalická fosfatáza (ALP) je metaloproteinový enzym katalyzující hydrolýzu monoesterů kyseliny fosforečné v alkalickém prostředí (v optimu pH 9,5–10,5) na kyselinu fosforečnou a alkohol. Ovlivňuje metabolismus makroergických fosfátových vazeb a napomáhá transportu anorganických fosfátů přes buněčnou membránu.



Výskyt ALP
Alkalická fosfatáza se vyskytuje výhradně v cytoplazmatických membránách – v epitelu vývodových cest žlučových, játrech, kostech, střevech, placentě, srdci a v plicích.

Zvýšené hodnoty
Zvýšené hodnoty ALP se vyskytují u:
 * intra- i extrahepatální cholestázy,
 * reparačních procesů kostí (díky zvýšené činnosti osteoblastů),
 * zlomenin,
 * metastáz v kostech,
 * Pagetovy choroby,
 * osteomalácie,
 * virové hepatitidy (při malém zvýšení oproti hodnotám AST a ALT),
 * nádorových onemocnění jater (při velkém zvýšení oproti hodnotám AST a ALT),
 * bakteriálních infekcí,
 * střevních onemocněních,
 * selhání ledvin,
 * biliární cirhózy,
 * hyperparatyreózy,
 * a při růstu kostí u dětí (dle aktivity osteoblastů).

Snížené hodnoty
Nacházíme ve vzácných případech a to u:
 * intoxikace vitaminem D,
 * léčby antiepeleptiky nebo hypolipemiky,
 * a hereditární hypofostatemie.

Izoenzymy ALP
Alkalická fosfatáza tvoří více než 17 izoenzymů, klinicky nejdůležitější jsou 4 z nich. Tři tkáňově specifické izoenzymy: střevní, placentární a placentárnímu podobný – Reganův placentární izoenzym, který vzniká při specifickém nádorovém bujení, a od placentárního je těžko rozeznatelný. A jeden tkáňově nespecifický, který zahrnuje 3 izoformy: jaterní, kostní a ledvinovou.

U dětí převažuje izoenzym kostní (až 85 % z celkové ALP), u těhotných žen zase převládá izoenzym placentární (až 50 % z celkové ALP).

Stanovení celkové ALP
Vyšetření se provádí z nehemolytického séra nebo plazmy. Materiál se odebírá do skleněných nebo plastových zkumavek s obsahem antikoagulačního činidla (Li-heparin) a musí být zpracován do 4 hodin od odběru. Vyšetření se nesmí provádět z hemolytického séra, protože z erytrocytů by se uvolnily fosfomonoesterázy, což by způsobilo falešně pozitivní výsledek. Stanovení vadí také opětovné zamrazení a ohřátí vzorku. Při stanovení se nesmí vzorek setkat s EDTA, oxaláty a citráty, které tvoří cheláty a inhibují aktivitu ALP tím, že vyváží zinečnatý kationt z jejího aktivního centra.


 * Standardizovaná metoda:
 * Měření aktivity ALP se provádí při 37 °C v TRIS pufru (tris-hydroxymethyl-aminomethan) s aktivátorem při pH 10,4. Principem reakce je katalýza štěpení 4-nitrofenylfosfátu na 4-nitrofenol a fosforečnan, kdy sledujeme nárůst absorbance na spektrofotometru při 405 nm, která je přímo úměrná příbytku množství 4-nitrofenolu a tudíž přímo úměrná aktivitě ALP.

Stanovení izoenzymů ALP
Stanovení se provádí z nehemolytického séra, materiál se odebírá nalačno. Ihned po odběru se vzorek musí transportovat do laboratoře, kde je až do zpracování (maximálně jeden týden) uložen v chladničce.

ELFO
Využívá rozdělení jednotlivých izoenzymů na základě různých pohyblivostí. Následně se provede denzitometrická kvantifikace.
 * anoda ← (nejrychlejší) jaterní > placentární > kostní > střevní (nejpomalejší) → katoda


 * Normální hodnoty izoenzymů:
 * kostní – 60–70 %;
 * jaterní – 30–50 %;
 * střevní < 20 %.

Inaktivace teplem

 * Směs se na 10 minut zahřeje na 56 °C, tím dojde k úplné inaktivaci kostního izoenzymu. Ve směsi zůstane izoenzym jaterní, který se při teplotě nad 56 °C rozpadá. Zato placentární izoenzym je velice termostabilní, vydrží teploty až k 65 °C. Tímto způsobem můžeme při různých teplotách změřit aktivitu různých izoenzymů.

Inhibiční metody

 * Zde je využíváno různých inhibičních roztoků, např: Použitím α-fenylalaninu je možné inhibovat zcela izoenzym střevní a polovinu izoenzymu placentárního. Močovina zcela inhibuje izoenzym kostní, z 30 % izoenzym střevní a placentární a z 50 % izoenzym jaterní. Pomocí homoargininu se zase inaktivují izoenzymy kostní a jaterní.