Methods of Staining Bacteria, Micromycetes and Parasites

K základním metodám mikrobiologie patří příprava nativního nebo fixovaného preparátu.

Nativní preparát
Neobarvené nativní preparáty se v bakteriologii příliš nevyužívají. Nativní preparáty slouží hlavě k diagnostice parazitárních a mykotických infekcí. V bakteriologii se nativní preparát využívá například pro pozorování pohybující se Treponema pallidum pomocí mikroskopie v zástinu.

Postup přípravy nativního preparátu je jednoduchý. Na podložní sklíčko kápneme kapku fyziologického roztoku, do kterého kličkou vneseme vzorek. Následně to celé přiklopíme krycím sklíčkem (bez bublinek) a pozorujeme mikroskopem.

Fixovaný preparát
K fixaci preparátu dochází před barvením. Na sklíčko kápneme fyziologický roztok a do této kapky přidáme kličkou vzorek. Celé to pak necháme zaschnout. Nakonec připravený vzorek fixujeme pomocí plamene kahanu nebo například metanolem. Účelem fixace je usmrcení bakterií a jejich pevné přichycení ke sklíčku, aby se při následném barvené nesmyly.

Barvení preparátů
Barvení preparátů se provádí po fixaci vzorku. Barvení jednotlivých struktur mikroorganismů nám ulehčuje jejich identifikaci.

Pro bakterie o velikosti několika µm se používá mikroskopie s imerzním objektivem s 1000x zvětšením pozorování. Preparát na sklíčku zakápneme kapkou imerzního oleje, krycí sklíčko se nepoužívá. Poté ponoříme objektiv do imerzního oleje. Na konci pozorování je nutné očistit objektiv (buničinou navlhčenou benzinem). náhled|331x331pixelů|Grampozitivní (tmavě modré) a gramnegativní (růžové) bakterie Typy barvení:


 * barvení podle Grama
 * barvení na acidorezistenci podle Ziehl-Neelsena
 * barvení pouzder tuší podle Burriho
 * barvení metachromatických granulí podle Alberta

Barvení podle Grama
Barvení podle Grama rozděluje bakterie na grampozitivní a gramnegativní. Toto barvení je rychlé a jednoduché.

Principem je absorpce komplexu krystalové violeti s Lugolovým roztokem (roztok jodu v jodidu draselném) do bakteriálních buněk. Rozdělení bakterií do dvou skupin je založeno na rozdílném vymývání tohoto komplexu organickým rozpouštědlem (acetonem) z bakteriální stěny. Správnější název by tedy bylo Gramovo odbarvování. K různému odbarvení dochází díky odlišné struktuře bakteriální stěny. Bakteriální stěna obsahuje peptidoglykan murein.

Stěna gramnegativních bakterií je tenká, obsahuje velké množství lipidů. Tenká stěna umožňuje lepší průnik organického rozpouštědla a snadné vymytí komplexu krystalové violeti z bakterií. Proto se musí stěna dobarvovat karbolfuchsinem na růžovo.

Stěna grampozitivní bakterií je silnější a vrstevnatá. Silná stěna v sobě zadrží krystalovou violeť ve vazbě s jódem a nedochází k vymývání. Grampozitivní bakterie se díky krystalové violeti zbarví tmavě modře až modrofialově. náhled|222x222pixelů|Barvení dle Grama Postup barvení dle Grama:


 * 1) Na připravený fixovaný preparát kápneme krystalovou violeť a necháme ji působit.
 * 2) Po 30 sekundách opláchneme vodou.
 * 3) Pak přidáme Lugolův roztok, který obsahuje jód (jód tvoří komplex s krystalovou violetí).
 * 4) Po 30 sekundách opláchneme vodou.
 * 5) Poté aplikujeme rozpouštědlo (etanol nebo aceton).
 * 6) Po 30 sekundách opláchneme vodou – grampozitivní bakterie díky silné stěně zůstanou obarveny, gramnegativní bakterie se odbarví.
 * 7) Nakonec přidáme karbolfuchsin nebo safranin pro kontrast a dobarvení.
 * 8) Po 30 sekundách opláchneme vodou – grampozitivní bakterie poté zůstávají stejně barevné, gramnegativní bakterie se barví do růžova.

Barvení na acidorezistenci podle Ziehl-Neelsena
Barvení na acidorezistenci je určeno pro acidorezistentní bakterie rodu Mycobacterium a Nocardia. Tyto mikroorganismy se nebarví podle Grama kvůli buněčné stěně, která obsahuje lipidy s mykolovými kyselinami. Tyto lipidy špatně absorbují barviva a musejí se proto barvit za horka (takto absorbovaná barviva se pak nedají vymýt ani odbarvením rozpouštědly s příměsí silných kyselin (acidorezistence) nebo zásad).

Acidorezistentní bakterie jsou karbolfuchsinem obarveny růžově až červeně. Kontrastní pozadí je je zelené nebo modré.

Postup barvení dle Ziehl-Neelsena:


 * 1) Na fixovaný preparát se nanese karbolfuchsin a při tom se zahřívá pomocí kahanu (barvení za horka).
 * 2) Následně v šikmé poloze odbarvíme preparát pomocí kyselého alkoholu.
 * 3) Preparát opláchneme v tekoucí vodě.
 * 4) Poté dobarvujeme preparát pomocí malachitové zeleně (nebo metylénové modři) po dobu 30 sekund.
 * 5) Poté preparát opět opláchneme tekoucí vodou.
 * 6) Necháme usušit.

Barvení podle Giemsy
Principem je absorpce Giemsova barviva, které je na bázi eosinu a methylenové modři. Preparátem může být tlustá krevní kapka nebo fixovaný vaginální výtěr. Mezi hledané organismy patří prvoci, bakterie, rickettsie, chlamydie, mykoplazmata či virové inkluze. Bakterie se barví modře, pouzdra světle modře, sliz růžově.

Fixovaný preparát se podle požadavků ponořuje do koncentrovaného nebo zředěného Giemsova roztoku na 2 minuty, 30 minut nebo přes noc. Následně se preparát opláchne vodou, usuší a můžeme ho pozorovat imerzním objektivem.

Barvení podle Alberta
Barvení podle Alberta se využívá pro znázornění metachromatických granul. Fixovaný preparát se převrství Albertovým roztokem, pak se opláchne vodou a osuší. Následně se preparát přelije Lugolovým roztokem a znovu se opláchne a usuší. Bakterie jsou obarveny zeleně, metachromatický granula jsou modrá. Využívá se hlavně u Corynebacterium spp.

Barvení podle Writz – Conklina
Barvení podle Writz – Conklina slouží k znázornění bakteriálních spor, např. spory Clostridium tetanii. Fixovaný preparát se převrství roztokem malachitové zeleně a po opláchnutí se dobarvuje zředěným karbolfuchsinem. Bakteriální buňka je růžová, spory jsou zelené.

Barvení podle Burriho
Barvení podle Burriho slouží k průkazu bakteriálních pouzder. Na podložním sklíčku se smísí kapka bzorku s tuší. Poté se zhotoví tenký nátěr, který necháme zaschnout. Preparát se dobarvuje krystalovou violetí. Bakterie se obarví fialově(díky krystalové violeti). Pouzdro se nebarví, díky tomu vzniká okolo bakterie halo efekt, který ohraničuje buňku od černého okolí, které je zbarveno tuší.

Barvení mikromycet
Candida albicans a rod Aspergillus se barví se podle Grama. Genciánová violeť je specifické barvivo pro Zygomycety. Cryptococcus je kvasinka s polysacharidovým pouzdrem, takže se barví tuší podle Burriho.

Barvení v parazitologii
Využívá se barvení podle Giemsy-Romanowského a barvení Gomoriho trichromem. Na parazity o velikosti desítek až stovek µm se používá suchý objektiv se 4x zvětšením. Barvení dle Ziehl-Neelsena se využívá na střevní kokcidie (Toxoplasma gondii).

Fluorescenční barvení
Nespecifická fluorescence se využívá v mykologii, kdy fluorescenční barvivo barví chitin v buněčné stěně hub. Fluorescenční barvení se také využívá v diagnostice tuberkulózy.

Související články

 * barvení dle Grama
 * bakteriální stěna

Použitá literatura

 * HORÁČEK, Jiří. Základy lékařské mikrobiologie. 1. vydání. Praha : Nakladatelství Karolinum, 2000. sv. 1. ISBN 80-246-0006-4..


 * GOERING, Richard V a Hazel M DOCKRELL. Mimsova lékařská mikrobiologie. 5. vydání. Praha : Triton, 2016. 568 s. ISBN 978-80-7387-928-0.