Immunochemical methods

Imunochemické metody jsou založeny na interakci antigen-protilátka. Pomocí těchto metod stanovujeme přítomnost patogenů nebo prokazujeme, zda vzorek obsahuje specifické protilátky vůči danému antigenu či nikoliv. Antigen je makromolekulární látka přirozeného nebo umělého původu, kterou organismus rozpoznává jako cizí. Pokud je antigen (v tomto případě imunogen) vpraven do organismu, navodí imunitní odpověď. Dojde ke stimulaci lymfocytů, které po diferenciaci produkují plasmatické buňky schopné sekretovat protilátky. Protilátka je tedy molekula, které je schopna navázat se na antigen a tím spustit obrannou reakci organismu. Rozlišujeme polyklonální protilátky (namířeny proti více epitopům určitého antigenu), monoklonální protilátky (namířeny proti jednomu epitopu antigenu) a rekombinantní protilátky (kombinace obou předchozích).

Jednoduchá radiální imunodifúze
Vzorky s antigenem jsou aplikovány do jamek v agarózovém gelu obsahujícím specifickou protilátku. Během 2–3 dnů inkubace při pokojové teplotě antigen radiálně difunduje v tomto gelu. Při reakci antigenu se specifickou protilátkou se vytvoří imunoprecipitační prstenec, jehož plocha je úměrná množství antigenu. Výsledky vzorků vyhodnocujeme pomocí speciálního pravítka, kdy měříme plochu prstenců a tím stanovíme koncentraci antigenu ve vzorcích.

Imunoprecipitace spojená s metodou imunoturbidimetrie
Imunoprecipitace je založena na interakci antigen-protilátka a vytvoření imunoprecipitátu. Podmínkou je přítomnost polyvalentního antigenu (reakce antigenu s více epitopy). Jestliže do několika zkumavek dáme konstantní množství protilátky a vzestupné množství antigenu, vzniknou oné imunoprecipitáty. Podstatou imunoprecipitátu je prostorová mřížka, kde se propojují epitopy (vazebná místa A) antigenu s paratopy (vazebná místa P) protilátek. Po určité době dosáhne jisté velikosti, kdy konečně precipituje. Vyjádření množství imunoprecipitátu na množství protilátky a antigenu popisuje '''tzv. imunoprecipitační křivka'''.

Soubor:Imunoprecipitační křivka.png´

Pokud stanovujeme koncentraci antigenu v neznámém vzorku (př. plazmatické bílkoviny), použijeme metodu imunoturbidimetrie. Při reakci antigenu s protilátkou vzniká zákal. Pomocí spektrofotometru změříme intenzitu světla, které nebylo zákalem rozptýleno a stanovíme koncentraci antigenu v neznámém vzorku (použijeme pouze vzestupnou část křivky, kde je koncentrace antigenu přímo úměrná koncentraci precipitátu).

Imunonefelometrie
Metoda je založena na měření intenzity rozptýleného světla, které vychází z roztoku všemi směry. Měří se pod úhlem, který je odlišný od směru dopadajícího záření (obvykle 45° nebo 90°). Koncentraci antigenu stanovujeme stejně jako u imunoturbidimetrie. Používáme nefelometr, kdy zdrojem záření je obvykle laser.

Soubor:Imunoturbidimetrie a imunonefelometrie.png

Imunoanalytické metody se značenými reaktanty
Metody jsou založeny na značení antigenu nebo protilátky takovou látkou, která je citlivější než průkaz imunoprecipitátu. Značkou může být enzym (enzymová imunoanalýza), radioizotop, ale i fluorescenční nebo chemická látka.

Enzymová imunoanalýza
Tyto metody využívají enzymů ke značení antigenu nebo protilátky. Jako značka slouží peroxidáza nebo alkalická fosfatasa. Extistují dvě hlavní techniky, a to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) a EMIT (Enzyme Multiplied Immunoassay Technique).

Homogenní enzymová analýza
Vzorek, který obsahuje stanovovaný antigen se smíchá se známým množstvím téhož antigenu s navázaným enzymem (konjugát) a příslušnou protilátkou v omezeném množství. Při imunochemické reakci soutěží neznačený antigen s konjugátem o navázání na omezené množství protilátky. Při vazbě protilátky na enzym konjugátu může nastat konformační změna enzymu spojená se ztrátou aktivity. Čím je ve vzorku více neznačeného antigenu, tím více molekul protilátky s ním reaguje a tím zůstane zachováno více enzymové aktivity v konjugátu. Tato metoda se využívá ke stanovení nízkomolekulárních látek (léky, hormony).

Heterogenní enzymová analýza
náhled|ELISA Jednou z metod je tzv. ELISA, kdy stanovujeme množství antigenu nebo protilátek. Antigen nebo protilátka jsou zde pevně zakotveny na pevné fázi, kterou může být buď povrch mikrotitračních jamek, zkumavky či magnetické částice. ELISA metody dělíme na kompetitivní a nekompetitivní (sendvičové).

Kompetitivní technika
U tohoto typu stanovení soutěží o vazbu na omezený počet vazebných míst na pevném povrchu imobilizovaných protilátek neznačený ligand s ligandem značeným enzymem. Po krátké inkubaci je oddělen komplex vázaný od volného. Po promytí (odstranění nenavázaných molekul) je přidán substrát a enzym přítomný ve vázané frakci jej přemění na barevný produkt. Množství vzniklého produktu je nepřímo úměrné koncentraci neznačeného ligandu v testovaném vzorku. Následuje měření absorbance vzorků. Jamky, které obsahují jen konjugát ligandu s enzymem jsou nejintenzivněji zabarveny a úbytky zabarvení v jamkách jsou úměrné množství nekonjugovaného antigenu. Standardní křivky dostaneme vynesením koncentrace antigenu a absorbance. Z křivky stanovíme koncentraci antigenu vzorků (popř. to necháme udělat PC – Elisa reader).

Nekompetitivní (sendvičová) technika
Pomocí této metody stanovujeme protilátky nebo antigeny, které mají nejméně dva různé determinanty. Na povrchu jamek mikrotitračních stripů je navázán specifický antigen. V neznámých vzorcích, které přidáváme do jamek, vyšetřujeme přítomnost protilátek proti tomuto antigenu. Pokud vzorky obsahují danou protilátku proti danému antigenu, navážou se na antigen a vytvoří imunokomplex. Po promytí nenavázaných složek vzorku se imunokomplexy detekují konjugátem (bílkovina s navázaným enzymem). Vznikne '''tzv. „sendvič“, který je tvořen antigenem ve stěně stripu, protilátkou a konjugátem'''. Množství navázaných značených protilátek se zviditelní enzymovou reakcí. Po promytí přidáme substrát, který je pomocí peroxidázy přeměněn na barevný produkt. Enzymovou reakci zastaví přidáním STOP roztoku (slabá kyselina). Podle intenzity zbarvení vyhodnotíme, zda vzorky obsahovaly protilátky či nikoliv.

Související články

 * Turbidimetrie

Zdroje
Vlastní poznámky z hodin seminářů lékařské biochemie

http://che1.lf1.cuni.cz/html/imuno.pdf

https://ulbld.lf1.cuni.cz/file/1045/Imunochemie 201314teorie.pdf