Biochemical blood analysis

Biochemical blood analysis
In order to correctly assess the state of health, it is necessary to obtain as much information as possible. The results of laboratory tests are a source of valid information that reflects changes in the body's metabolism and can be used in assessing the patient's health.

According to data presented by the World Health Organization WHO, laboratory examination provides around 80% of the information leading to the establishment of a correct diagnosis.

The most extensive and important part of the laboratory examinations is the analysis of blood, blood serum or plasma. Blood is a relatively easily available material, and its composition reflects a number of biochemical processes taking place in various tissues.

Another relatively frequently analyzed material is urine. Analyzes of other body fluids (gastric secretions, duodenal contents, amniotic fluid, cerebrospinal fluid, saliva, sweat, etc.) are required specifically only for a limited number of examinees, their frequency is considerably lower, and they are often only performed in specialized workplaces.

A doctor can use a wide range of laboratory methods at different stages of the diagnostic and therapeutic process. However, it is necessary to indicate them rationally, to use them effectively, then to evaluate and correctly interpret the obtained results.

Laboratory tests performed in clinical-biochemical laboratories are:
 * according to availability - basic, specialized, highly specialized,

Directly in the doctor's office or at the patient's bedside, some examinations can be performed with advantage, providing immediate information without the need for analysis in a laboratory (so-called bed-side diagnostics, point-of-care testing (POCT), near-patient testing).
 * in terms of execution speed - routine, statistical, from vital indication.

Blood sampling
Blood for collection can be obtained from veins, arteries or capillaries. Venous blood is most often collected (mostly from the elbow), less often capillary blood (e.g. from a finger, earlobe or from a warmed foot in a newborn). Arterial blood is taken only exceptionally, mainly for blood gas analyses.

Venous blood sampling
In terms of procedure and equipment for venous blood collection, we distinguish between two collection methods:
 * open sampling system – the worker performing the sampling is in direct contact with the biological material
 * Sampling is done either with a needle directly into the test tube or into a syringe with a very gentle pull using a plunger


 * closed collection system – handling of the sample after collection is done directly in the collection syringe/tube.
 * The worker is thus protected against contamination by the patient's blood during collection, the biological material itself is protected against possible contamination from the outside and against possible breakage during transport and centrifugation. Individual closed syringes/vacuum tubes are color-coded according to the type of preparation substance present inside (hemocoagulation accelerators, separation gel, heparin, EDTA, …). he separation gel enables perfect separation of the serum from the blood coagulum after centrifugation (by creating an intermediate layer). It is thus possible to insert the sampling syringe/tube directly into the analyzer. The used material is easily disposed of by burning.

When using a closed system, sampling is done in a closed syringe or vacuum tube. Collection in a closed syringe. The collection kit contains a syringe to which a needle is attached. When blood is drawn into the syringe, it is drawn using a piston. If the patient has sufficiently strong veins, the piston on the syringe can be pulled out and locked immediately before collection, thus creating a vacuum in the test tube through which the blood is drawn. After sampling, the plunger breaks off and the syringe becomes a closed tube. The sampling method is chosen according to the condition of the patient's veins.

Collecting in a vacuum tube. The collection kit includes a needle holder with hemostatic valve, a needle and an appropriate vacuum tube. Before sampling, a suitable needle is inserted into the holder, the position of the vein is stabilized with the thumb at a distance of 2 to 5 cm below the sampling site, a venipuncture is performed, and only then appropriate tubes are gradually inserted. The vacuum tube must not be placed on the inner needle of the holder before venipuncture, as the vacuum in the tube would be cancelled. The vacuum in the tube ensures both adequate filling of the tube and a sufficient ratio of blood to anticoagulant. Principles of venous blood collection
 * find out an allergy to disinfectants or a certain type of patch,
 * before taking the arms, the patient does not exercise the hand (distortion of the examination series), the pressure can be increased by opening and closing the palm,
 * disinfect the injection site (Jodonal B, Persteril, Jodisol, Ajatin),
 * if the veins are clearly visible, take the sample from the unstretched arm,
 * if a tourniquet is used (not longer than 1 min), it should be released immediately after the vein is punctured,
 * if the tourniquet has been used for a long time or the patient has intensively exercised with the hand, this should be indicated in the request form,
 * after sampling, apply a cotton swab moistened with a disinfectant to the injection site,
 * when collecting non-coagulable blood, mix the blood immediately after filling by repeatedly rotating the collection tube at least 5 times (do not shake!).

Capillary blood sampling
Capillary blood is used in cases where only a small amount of sample is needed. Main principles when taking:
 * by warming the injection site (belly of the finger, earlobe, heel in infants) to ensure good blood circulation (apply a warm, moist compress 3 minutes before the actual sampling)
 * disinfect the injection site
 * the injection should be directed from the side into the belly of the toe (heel), where there is better blood flow than in the middle
 * after being impaled with a lancet, wipe off the first drop (tissue fluid admixture), support the formation of further drops with light pressure (tissue fluid admixture is present in the blood during strong squeezing)
 * blood is usually collected in special capillary blood tubes or in small plastic or glass tubes. In strip tests, a drop of blood is applied directly
 * after sampling, apply a cotton swab moistened with a disinfectant to the injection site

Blood processing
Blood collected without the use of anticoagulants clots after a shorter time, as a result of the conversion of soluble fibrinogen into a fibrous network of fibrin. Serum is obtained by centrifuging the clotted blood. Precipitation time must be sufficient (at room temperature after 15-30 min). However, premature separation of serum from blood elements can lead to additional fibrin formation and serum coagulation. Non-clotting blood must be obtained for some clinical-biochemical examinations. Blood is collected in containers with the addition of anticoagulant (anti-clotting) agents. Plasma is obtained by centrifuging non-clotting blood. Blood can be centrifuged immediately after collection, which saves time in acute conditions. Plasma or serum should be separated as soon as possible, but no later than 2 hours after collection (for determination of potassium ions within 1 hour after collection). To separate blood elements from plasma, or blood clots from serum, centrifuges are used. Closed collection syringes/tubes with blood are placed in the so-called rotor, where the sedimentation of substances with a higher density is accelerated by means of centrifugal force. An overload approximately 1000 times greater than Earth's gravity is used to perfectly centrifuge whole or clotted blood. Blood centrifugation is always carried out in closed tubes (preventing the formation of an aerosol, possibly contaminating the sample) for about 10-15 minutes at room temperature or at a temperature of 4 °C.

Preparation of blood plasma
During collection, the collected blood in the test tube is mixed well with an anti-coagulant substance (anticoagulant agent) by careful swirling, which dissolves in the blood and keeps it non-coagulating for a certain time (the volume of the blood does not change). The anticoagulant is put into a test tube in the form of a solution, which is allowed to evaporate. Non-coagulating blood with heparin can also be obtained by sucking the heparin solution from the ampoule into the syringe and creating a fine heparin film on the surface by repeated movements of the piston. We will then take blood into the syringe prepared in this way. Closed sampling systems are already filled with anticoagulants during production. Approximate doses of anticoagulant to prevent clotting of 1 ml of blood:

The principle of action of the first three coagulating agents in the table is the binding of calcium ions and thereby reducing their concentration in the blood. Calcium ions are necessary for the activation of several blood clotting factors (factors II, VII, IX and X. Heparin binds to plasma antithrombin III and increases its affinity to thrombin. Some clotting factors are inactivated by the effect of thrombin. When using anticoagulants, it is necessary to take into account by the fact that the composition of the collected blood may change. For example, all anticoagulant agents weigh Ca2+ and Mg2+, therefore it is necessary in the case of determining Ca2+ use specially prepared heparin. It is also necessary to take into account that during coagulation, not only are coagulation factors activated, but also some components are released from disintegrated platelets.

Task: preparation of blood plasma (link to pdf)

Factors affecting the result of laboratory examination
The results of laboratory tests are influenced by a number of factors. Their ignorance or underestimation can lead to incorrect interpretation of the result. The laboratory examination includes three phases:
 * pre-analytical part – preparation of the patient, collection of biological material and its transport to the laboratory, storage of the sample before analysis, preparation of the sample for processing;
 * analytical part – own analysis and calculation of the result;
 * post-analytical part – data validation and their transfer and interpretation.

a) Factors of the pre-analytical phase
The most important phase of the examination from the point of view of possible influence on the result is the pre-analytical part, during which the result can be influenced by biological influences (influential and uninfluential), the method of material collection, its transport and storage. If possible, the effort is to eliminate these factors, or minimize, otherwise they must be taken into account when interpreting the result. Biological influences uncontrollable

Race, ethnic group of the population – different races/ethnic groups have different metabolic pathways, but also the amount of muscle mass, different physiological values ​​of some analytes, or a different frequency of disease occurrence given by a different frequency of certain genes.

Pohlaví – většinou neovlivňuje fyziologické hodnoty analytů, pokud ano, tak u žen jsou hodnoty o něco nižší než mužů. Rozdíly jsou dány především zastoupením hormonů a habitem. Před pubertou jsou rozdíly hodnot mezi dívkami a chlapci minimální.

Věk – většina parametrů v dětském věku má nižší hodnotu horní referenční meze v porovnání s dospělou populací. Řada biochemických systémů nebo dějů je spojena s určitou fází vývoje organismu. Vysoké fyziologické hodnoty během dospívání jsou dány především vývojem skeletu.

Gravidita – uplatňuje se několik mechanismů, které vedou ke změnám koncentrací analytů, aktivit enzymů a počtu komponent během gravidity. Může se jednat o změny v tvorbě hormonů a jejich účinku na organismus, vliv placenty, přestup látek z plodové vody, apod.

Biorytmy – jedná se o pravidelné lineární (věk) nebo cyklické změny v metabolismu pod vlivem hormonů hypotalamu a hypofýzy (denní, měsíční, …) nebo změny způsobené klimatickými či sezónními podmínkami, které lze s určitou pravděpodobností předpovídat. U každého jedince se však vyskytují též necyklické, nepredikovatelné biorytmy.

Biologické vlivy ovlivnitelné

Hmotnost organismu – může ovlivnit koncentrace analytů změnou distribučních objemů. S obezitou pozitivně koreluje koncentrace např. LDL-cholesterolu, triacylglycerolů, močové kyseliny, inzulinu. Fyzická aktivita – ovlivňuje změnu složení tělních tekutin a závisí na délce a intenzitě fyzické zátěže. Akutní silová a vyčerpávající zátěž zvyšuje podíl anaerobního metabolismu, vytrvalostní zátěž aerobní metabolismus. Během fyzické aktivity dochází k zvýšené utilizaci substrátů (glykémie zpočátku nepatrně stoupá, po delší zátěži klesá, klesá triacylglycerolemie, zvyšuje se koncentrace volných mastných kyselin), ke změně metabolismu ve tkáních (zvýšená tvorba laktátu, pokles pH), k přesunu tekutiny z intravazálního prostoru do intersticiálního (zvýšení hematokritu, celkové bílkoviny a látek na ni vázaných), ke změně koncentrace mnohých hormonů.

Dieta/hladovění – ovlivňují různými mechanismy vyšetřované analyty – závisí na složení a množství přijaté potravy a tekutin. Před příjmem stravy a během jídla se vyplavují hormony a enzymy. Při dehydrataci organismu se zvyšuje hematokrit, ale i koncentrace řady látek. Strava bohatá na proteiny zvyšuje fosfáty, močovinu a močovou kyselinu. Strava bohatá na tuky snižuje podíl dusíkatých látek např. močové kyseliny. Strava bohatá na sacharidy zvyšuje např. laktátdehydrogenázu a snižuje koncentraci triacylglycerolů. Vegetariánská strava snižuje celkový i LDL-cholesterol a triacylglyceroly, zvyšuje celkový bilirubin a pH moče. Některé potraviny a nápoje mohou ovlivnit některé metabolické cesty, např. obsahují-li kofein, dochází ke zvýšení koncentrace katecholaminů, glukózy a volných mastných kyselin.

Kouření – ovlivňuje hladinu řady analytů především vlivem nikotinu. Kouření působí na metabolismus glukózy, zvyšuje koncentraci cholesterolu a triacylglycerolů.

Alkohol – konzumace alkoholu mění biochemické analyty odlišně podle toho, zda se jedná o akutní nebo chronický abúzus. Obecně ovlivňuje především metabolismus glukózy, triacylglycerolů a zvyšuje jaterní enzymy v krvi. Jednorázové požití alkoholu v mírné a střední dávce minimálně ovlivňuje vyšetření. Dlouhodobý abúzus vede k hypoglykemii a keto- a laktacidóze, zvyšuje se koncentrace močové kyseliny.

Léky – mohou ovlivnit biochemická vyšetření více mechanismy, např. indukují/inhibují jaterní enzymy, ovlivňují vazbu na transportní bílkoviny, působí cytotoxicky nebo rušit vlastní stanovení. Stres – ovlivňuje produkci hormonů, které následně mění metabolismus řady látek. Stres často doprovází závažnější onemocnění, ale u některých osob třeba i samotný odběr krve. Zevní prostředí – může mít nezanedbatelný vliv na metabolismus a následně i na koncentraci řady analytů. Jedná se o nadmořskou výšku (od výšek nad 3000 m), teplotu prostředí, ale také geografickou lokalizaci – venkov, město. Cestování přes časová pásma se projevuje změnou některých analytů, nejčastěji se jedná o retenci sodných iontů a tekutin s normalizací za 2 dny po návratu. Mechanické vlivy – např. svalové trauma, intramuskulární injekce zvyšují aktivitu ALT, AST, CK a koncentraci myoglobinu, tlak dělohy ve vysokém stupni gravidity zvyšuje aktivitu ALT, digitální vyšetření prostaty zvyšuje aktivitu prostatického specifického antigenu (PSA).

Odběr materiálu

Hlavní roli v celém procesu správného laboratorního vyšetření hraje poučení pacienta.

Odběr nalačno − doporučuje se, aby pacient cca 10–12 hodin nejedl a byl v relativním klidu. Doporučuje se též vypít ráno cca 2–3 dl vody. Nedodržením lačnění vznikají zkreslené nálezy v parametrech sacharidového a lipidového metabolismu. Pro některá speciální vyšetření nebo funkční testy jsou předepsaná opatření dietní nebo režimová (PSA může být pozitivní po jízdě na kole).

Doba odběru – koncentrace některých látek značně kolísá během dne (např. glukóza, triacylglyceroly, hormony), jiných během měsíce či roku. Plánované odběry se provádí většinou v ranních hodinách. Poloha při odběru ovlivňuje koncentraci proteinů resp. látek, které se na proteiny vážou (např. celkové proteiny, albumin, enzymy, lipidy, ionty Ca2+, Fe3+). Ve stoje dochází k úniku vody z intravaskulárního prostředí a tedy koncentrace zmíněných látek se zvyšuje o 5–15 %. Standardní poloha pacienta při odběru je poloha vsedě.

Použití turniketu – jeho přiložení nemá být delší než 1 minuta, pacient nemá paží „pumpovat“. Při delším zaškrcení končetiny (cca 5 min) a výraznějším cvičení dochází až k 10% změně aktivity nebo koncentrace řady analytů. Tato změna je dána nejčastěji přestupem nízkomolekulárních látek z intravaskulárního prostoru do intersticia v důsledku zvýšení filtračního tlaku přes kapilární stěnu a metabolickými změnami v místě zaškrcení (anaerobní metabolismus). Komprese žíly/prstu ovlivňuje koncentraci krevních plynů, laktátu a pH.

Hemolýza (viditelná při koncentraci hemoglobinu > 0,2 g/l) – v hemolytickém vzorku je zvýšená koncentrace analytů, jejichž koncentrace uvnitř erytrocytů je vysoká (např. celkové proteiny, laktátdehydrogenáza, kyselá fosfatáza, aspartátaminotransferáza, z iontů především K+, fosfáty, Mg2+). Příčiny hemolýzy: použití příliš velké nebo malé jehly, rychlé vyprázdnění stříkačky, prudké třepání krve ve zkumavce, vlhkost v odběrové soupravě nebo ve zkumavce, přítomnost detergentů ve zkumavce, nesprávný poměr antikoagulancia a krve, uskladnění krve v lednici, ponechání v prostředí se zvýšenou teplotou (na slunci, nad radiátorem), centrifugace při vysokých otáčkách.

Transport Pro transport je vhodnější sérum/plazma než plná krev. Při transportu plné krve hrozí hemolýza. Při transportu se plná krev uchovává při teplotě 0 °C (tající led). Stabilizace vzorku/skladování

Při delším stání odebrané krve dochází k vyčerpání energetických zdrojů erytrocytů, které pak nemohou udržet základní metabolické děje (dochází k úniku K+ z erytrocytů do krve transportu Na+ opačným směrem). V závislosti na stanovovaném analytu se ke stabilizaci volí nízká teplota (4 °C, 0 °C (tající led), −20 °C, −80 °C), ochrana před světlem, úprava pH vzorku, přídavek stabilizátoru.

b)Faktory analytické fáze
Výsledek každého laboratorního vyšetření je charakterizován několikerými znaky, které určují do jaké míry odráží reálnou situaci a do jaké míry je ovlivněn chybami. Mezi základní analytické vlastnosti každé metody patří přesnost a pravdivost. Přesnost (precision) vyjadřuje míru shody výsledků, získanými opakovanou analýzou téhož vzorku za předem daných podmínek. Přesnost je obecný pojem. Míru rozptylu výsledků (xi), tedy číselnou hodnotu přesnosti, vyjadřuje pojem nepřesnost. Nepřesnost bývá uváděna jako výběrová směrodatná odchylka s (je uvedena v jednotkách měřeného analytu) nebo jako relativní směrodatná odchylka (variační koeficient) CV:


 * $$s = \sqrt{\frac{\sum\limits_{i=1}^n (x_i - \bar x)^2}{n - 1}} $$


 * $$CV = \frac{s}{\bar x} (\cdot 100 \%) $$
 * Podle podmínek, za kterých stanovení přesnosti probíhá rozlišujeme opakovatelnost a reprodukovatelnost metody. Opakovatelnost (repeatibility) označuje přesnost metody, kdy se všechny analýzy provádějí v jedné sérii měření, v témže dni a na témže přístroji. Pojem opakovatelnost je shodný s označením „přesnost v sérii“. Reprodukovatelnost (reproducibility) vyjadřuje přesnost v čase. Získá se výpočtem ze stanovení, která se provádějí postupně po dobu několika dní na jednom zařízení. Reprodukovatelnost bývá označována jako „přesnost mezi dny“.

Přesnost závisí pouze na rozdělení náhodných chyb, nemá vztah ke skutečné hodnotě výsledku. Náhodné chyby vznikají zcela nepravidelně působením náhodných vlivů, lze je statisticky vyhodnotit. Způsobují rozptyl výsledků měření, který lze charakterizovat přesností měření číselně vyjádřenou jako směrodatná odchylka s nebo variační koeficient CV. Jejich vliv na výsledek měření lze snížit zvýšením počtu měření.

Pravdivost (trueness, dříve správnost) vyjadřuje těsnost souhlasu mezi průměrnou hodnotou získanou z velkého počtu výsledků měření a dohodnutou referenční hodnotou (x0). Mírou pravdivosti je odchylka (bias), která vyjadřuje rozdíl mezi střední hodnotou výsledků a dohodnutou referenční hodnotou:

bias = 				bias =

Pravdivost metody je dána velikostí systematické chyby (bias), která odchyluje výsledek vždy jedním směrem. Systematické chyby lze předvídat a vypočítat a provést korekci výsledků. Dohodnutá referenční hodnota (x0) zastupuje skutečnou hodnotu, která ve skutečnosti je vždy neznámá. Získává se pomocí referenční metody ve velkém počtu laboratoří.

Správnost (accuracy) vyjadřuje těsnost souhlasu mezi individuálním (jediným) výsledkem měření a dohodnutou referenční hodnotou. Správnost kombinuje přesnost (charakterizovaná směrodatnou odchylkou s) a pravdivost (charakterizovaná biasem), tj. vlivy náhodných a systematických faktorů. Mírou správnosti je celková chyba (total error, TE):

TE = 1,96 ∙ s + bias

Spolehlivost (reliability) je dána přesností a pravdivostí měření. Představuje rozsah, který při opakovaném měření dosahují jednotlivé hodnoty.

střed| 500px |

Každý výsledek vyšetření je vždy v různé míře ovlivněn náhodnými a systematickými chybami. Důsledkem existence chyb je nejistota výsledku měření. Nejistota (uncertainty, u) představuje interval hodnot, v němž se výsledek analýzy (x) s určitou pravděpodobností nachází. Nejistota zahrnuje mnoho složek, přičemž nevýznamné se zanedbávají, významné se vyjadřují formou směrodatných odchylek (nebo variačních koeficientů) jako tzv. standardní nejistoty u (tj. číselně u = s). Nejvýznamnější náhodnou složkou nejistoty bývá standardní nejistota reprodukovatelnosti a nejvýznamnější systematickou složkou nejistoty standardní nejistota kalibrátoru. Proto celkovou (kombinovanou) standardní nejistotu (uc) lze zjistit ze vztahu: Skutečná hodnota se nalézá s určitou pravděpodobností v intervalu (v tzv. rozšířené nejistotě), který se získá vynásobením standardní kombinované nejistoty (uc) koeficientem rozšíření (k), který má pro 95% hladinu spolehlivosti hodnotu 1,96 (přibližně 2): Při dodržování zásad správné laboratorní praxe by výsledek laboratorního vyšetření měl vždy obsahovat i údaj o rozšířené nejistotě stanovení daného analytu. Rovněž hodnoty referenčních mezí nebo hraniční hodnoty by měly obsahovat údaj o nejistotě stanovení.

Systémy kontroly kvality
Správnost prováděných analýz je v klinicko-biochemických laboratořích kontrolována v pravidelných intervalech pomocí kontrolních vzorků s deklarovanou hodnotou stanovovaných analytů (interní kontrola kvality). Používají se zpravidla kontroly na dvou hladinách; jedna hladina je v oblasti referenčních hodnot, druhá v patologické oblasti. Za vyhovující se považují výsledky kontrolních analýz v rozmezí ±2 s. Výsledky kontrol se kromě číselné hodnoty zobrazují graficky. Laboratoř je povinně zapojena do systému externího hodnocení kvality. Externí hodnocení kvality je systém objektivního hodnocení laboratorních výsledků nezávislou organizací, které se provádí pravidelným porovnáváním výsledků měření hodnocených laboratoří navzájem a porovnáváním k referenčním hodnotám měření.

Validace výsledků (nálezů). Vzhledem k velkému množství provedených analýz (tisíce) a velkému procentu výsledků v referenčních mezích se průběžně provádí nejprve tzv. elektronická validace. Výsledky, které jsou v určeném rozmezí, nemají chybové hlášení a neliší se v určeném rozsahu od předchozího vyšetření (nálezu), jsou uvolněny k vydání na klinická pracoviště automaticky. Ostatní nálezy jsou pozdrženy a předloženy k validaci supervizorovi. Ten zohledňuje soulad ostatních provedených testů, předchozí vyšetření, diagnózu, případně další klinické údaje pacienta. Při jakýchkoli pochybnostech o správnosti provedených analýz se provede opakované stanovení k vyloučení náhodné chyby.

Interpretace výsledků
Laboratorní vyšetření poskytuje řadu důležitých informací pro určení/upřesnění diagnózy, volbu správného postupu léčby i sledování jejího průběhu, zjištění prognostických nebo rizikových faktorů. Výsledky laboratorních vyšetření se hodnotí ve vztahu s fyziologickými hodnotami, s výsledky dalších vyšetření, s anamnézou pacienta příp. se sleduje jejich změna v čase. Interpretace laboratorních vyšetření často vyžaduje spolupráci řady odborníků (klinického biochemika, hematologa, imunologa, genetika, mikrobiologa, toxikologa, farmakologa, aj.) s indikujícím lékařem. V případě opakování laboratorního vyšetření hraje podstatnou roli znalost charakteristiky vyšetřovaného analytu, především jeho biologický poločas, rychlost stimulace syntézy nebo degradace při patologickém procesu.

Porovnávání výsledků s referenčním intervalem
Při interpretaci výsledků biochemických vyšetření se nejčastěji provádí porovnávání s tzv. referenčními intervalem hodnot. Referenční interval zahrnuje 95 % referenčních hodnot, tzn. 5 % hodnot není započítáno (2,5 % nejvyšších a 2,5 % nejnižších). Referenční hodnoty jsou hodnoty získané od vybrané skupiny jedinců (věk, pohlaví, rasa) s definovaným stavem zdraví (minimálně 120 referenčních jedinců); závisí mj. na způsobu odběru, transportu a uchovávání vzorků (viz úkol 1.5), metodě stanovení a způsobu statistického vyhodnocení. Do této vybrané referenční populace nepatří např. těhotné a kojící ženy nebo apriori „zdraví“ dárci krve, jedinci nemocní, s genetickými predispozicemi, obézní, konzumenti alkoholu, drog apod.

Při statistickém hodnocení referenčních intervalů je třeba vyloučit odlehlé hodnoty, otestovat hodnoty z hlediska normálního rozdělení, případně zvolit vhodné postupy pro transformaci dat na normální rozdělení, určit referenční intervaly neparametrickými i parametrickými metodami, testovat vliv věku/pohlaví.

V závislosti na rozložení četnosti referenčních hodnot lze pro odhad referenčního intervalu použít parametrickou nebo neparametrickou statistickou metodu. Pokud referenční hodnoty mají normální rozložení četnosti (graficky vyjádřené Gaussovou křivkou) lze pro výpočet referenčních mezí použít tzv. parametrickou metodu s využitím matematických parametrů. Nejdříve se z referenčních hodnot se vypočte aritmetický průměr a směrodatná odchylka s:


 * $$\bar x = \frac{x_1 + x_2 +... + x_n}{n} = \frac{ \sum\limits_{i=1}^n x_i}{n}$$


 * $$s = \sqrt{\frac{\sum\limits_{i=1}^n (x_i - \bar x)^2}{n - 1}}$$

Z těchto parametrů se pak vypočtou odhady referenčních mezí:


 * $$\bar x \pm a \cdot s$$

Pokud má referenční interval obsahovat 95 % referenčních hodnot, dosadí se za koeficient a hodnota 1,96 (přibližně hodnota 2) – viz následující schéma.

Pokud referenční hodnoty nesplňují normální rozložení četnosti, lze je mnohdy pomocí vhodné matematické funkce (např. logaritmu, převrácené hodnoty) transformovat do normálního rozložení četnosti. Z transformovaných hodnot se zjistí aritmetický průměr a směrodatná odchylka, vypočtou odhady referenčních mezí, které se pak retransformují zpět.

Při určování referenčního intervalu lze použít též metodu neparametrickou. V tomto případě nezáleží na typu rozložení hodnot. Jen však nutno vyšetřit větší výběrovou referenční skupinu, než v předchozím případě, získané hodnoty seřadit vzestupně podle velikosti a na obou koncích oddělit příslušné procento hodnot (obvykle 2,5 %) – viz následující schéma.

Interpretace laboratorních výsledků pomocí 95% intervalu referenčních hodnot je zároveň vyjádřením pravděpodobnosti: u zdravého jedince existuje 95% pravděpodobnost, že jeho stanovená hodnota bude spadat do daného referenčního intervalu. Zbývajících 5 % představuje pravděpodobnost, že výsledek bude nižší (2,5% pravděpodobnost), resp. vyšší (2,5% pravděpodobnost) než dolní, resp. horní referenční mez.

Platnost referenčních mezí převzatých z literatury je nutné pro používanou metodu v laboratoři a pro danou populaci vždy ověřit.Se zvyšujícím se počtem různých stanovení se snižuje pravděpodobnost, že všechny stanovené parametry budou ležet uvnitř svých referenčních intervalů. Vzrůstá tedy pravděpodobnost, že (u „zdravého“ jedince) dostaneme některý z výsledků mimo referenční rozpětí.

Se zvyšujícím se počtem různých stanovení se snižuje pravděpodobnost, že všechny stanovené parametry budou ležet uvnitř svých referenčních intervalů. Vzrůstá tedy pravděpodobnost, že (u „zdravého“ jedince) dostaneme některý z výsledků mimo referenční rozpětí.

Rozhodovací analýza
Jiná interpretace výsledků je tzv. rozhodovací analýza. Při tomto hodnocení nepracujeme s intervalem referenčních hodnot („od – do“), ale s jedinou hraniční (kritickou) hodnotou (rozhodovacím limitem), která nám stanovený výsledek dovoluje označit jako pozitivní test (jsou to zpravidla vyšší hodnoty, než hodnota hraniční) nebo jako negativní test (zpravidla hraniční hodnota a hodnoty nižší). Pozitivita testu je spojována s určitým rizikem existujícího nebo budoucího onemocnění. Riziko může být vyjádřeno slovně (riziko zvýšené, vysoké, …) anebo číselně (pravděpodobnost v % apod.). Hraniční hodnota je zpravidla vypočítána tak, aby bylo dosaženo maxima tzv. vydatnosti testu, tj. nejvyšší pravděpodobnosti shody testu s diagnózou. Pojmy a jejich praktická aplikace budou blíže vysvětleny v klinické biochemii. Při sledování pacientů během progrese nemoci nebo léčebné terapie se laboratorní nálezy porovnávají s předchozími výsledky. Při tomto postupu není možné bezmyšlenkovité porovnávání údajů, ale je nutné počítat s analytickou a biologickou intraindividuální variabilitou daného parametru.

Kritický rozdíl
Výsledek laboratorního vyšetření ovlivňuje nejen chyba při analýze, ale i intraindividuální variabilita měřeného parametru. Pro posouzení dvou po sobě následujících výsledků měření v určitém časovém intervalu (závislém na sledovaném parametru) u téhož pacienta je nutné znát tzv. kritický rozdíl. Jedná se o minimální procentuelní rozdíl výsledků, způsobený změnou metabolismu, nikoliv analytickou chybou nebo variabilitou daného parametru v čase u daného jedince. Výpočet kritického rozdílu (critical difference, CD):

$$ CD = 2,77 \cdot \sqrt{CV^2_a + CV^2_i}$$


 * kde 2,77 je koeficient vztahující se k 95% intervalu pravděpodobnosti pro 2 následná měření; CVa analytický variační koeficient (mezilehlá přesnost měření); CVi intraindividuální biologická variace popisující rozptyl hodnot sledovaného parametru v čase u jednotlivce (viz databáze: https://www.westgard.com/biodatabase1.htm, hodnoty CVi jsou zde uvedeny jako CVw v procentech).

Kalkulátor CD je možné nalézt např. na webových stránkách České společnosti klinické biochemie http://www.cskb.cz

Je-li rozdíl dvou následných měření větší, než je hodnota CD, tak se tyto výsledky od sebe s určitou pravděpodobností (většinou 95%) liší, tj. nejsou způsobené analytickou ani intraindividuální biologickou variabilitou, ale odrážejí změnu klinického stavu pacienta. Pokud je rozdíl dvou následných měření menší než přípustná hodnota CD, vypočte se aritmetický průměr pro daný parametr. V případě překročení kritického rozdílu se provede po určitém čase třetí vyšetření.

Diagnostická správnost laboratorního vyšetření
Úkolem každého laboratorní vyšetření/testu by mělo být odlišit jedince s přítomností nebo absencí určitého onemocnění. U většiny laboratorních vyšetření však dochází k částečnému překrytí zdravých a nemocných, čímž vzniká navíc skupina zdravých s pozitivním testem (falešně pozitivních) a skupina nemocných s negativním testem (falešně negativních). Vyšetřované osoby můžeme tedy rozdělit do čtyř skupin (viz obr. 1-4 a pravdivostní tabulka níže).



Diagnostická citlivost (senzitivita) testu vyjadřuje pravděpodobnost, že pozitivní test vyjadřuje skutečně pozitivní diagnózu (jinak řečeno, že u nemocné osoby bude výsledek testu pozitivní neboli tzv. procento správně pozitivních nálezů):


 * $$diagnostick\acute{a} \ senzitivita = \frac{SP}{SP + FN} (\times 100 \%) $$

Diagnostická specifičnost (specificita) testu vyjadřuje pravděpodobnost, že negativní test vyjadřuje skutečně negativní diagnózu (jinak řečeno, že u zdravé osoby bude výsledek testu negativní neboli tzv. procento správně negativních nálezů):


 * $$diagnostik\acute{a}\ specifita = \frac{SN}{SN + FP} (\times 100\%)$$

Hodnota obou veličin se pohybuje v rozmezí 0–1 (0–100 %), čím vyšší hodnota, tím diagnosticky cennější test. V praxi se používají metody se specifičností aspoň 0,7. Diagnostická citlivost vyjadřuje výsledky testu ve vztahu k nemocným jedincům, diagnostická specifičnost ve vztahu ke zdravým jedincům. V ideálním případě umožňuje laboratorní test zcela jednoznačně od sebe oddělit jedince zdravé od nemocných (citlivost i specifičnost se rovnají 1). Pro rozhodování má zásadní význam hranice (diskriminační hodnota, cut-off value), od které můžeme považovat změnu koncentrace analytu za pozitivní nález. Mezi diagnostickou citlivostí a specifičností existuje nepřímá závislost, tzn. čím má laboratorní metoda vyšší diagnostickou citlivost (nižší falešnou negativitu), tím má nižší diagnostickou specifičnost (vyšší falešnou pozitivitu) a naopak.

Sdělování výsledků biochemického vyšetřování
Ve většině případů je vzorek krve nebo jiného biologického materiálu odesílán k vyšetření do centrální klinicko-biochemické laboratoře. Požadovaná vyšetření se pro zjednodušení značí do průvodních formulářů (žádanek). Žádanka by měla obsahovat příslušné informace o odběru materiálu, podmínkách skladování a o způsobu jeho transportu. Výsledky stanovení spolu s jejich interpretacemi (numerickými, grafickými, slovními) se pak vracejí zpět na výsledkovém listě (nálezové zprávě). Různá pracoviště používají různé typy formulářů a výsledkových listů.

Related Articles

 * Krev
 * Krevní plazma
 * Odběry krve na vyšetření
 * Krevní obraz
 * Hemokoagulace ▪ Vyšetření krevní srážlivosti ▪ Vyšetření krvácivosti ▪ Sedimentace erytrocytů
 * Biochemická analýza krve ▪ Laboratorní vyšetření acidobazické rovnováhy
 * Hemokultura ▪ CRP ▪ PCT