Examination of urinary sediment

Morphological components of urine can be detected by microscopic examination of the urinary sediment and more recently by flow cytometry.

Urine sediment analysis doesn´t belong to screening procedure. It´s used during these indications:
 * in case of a positive finding of a chemical examination of the urine (positive erythrocytes, protein, nitrites);
 * in case of positive leucocyte test with diagnostic strips;
 * in clinical suspicion of kidney and urinary tract diseases;
 * during follow up examination of patients with nephrological or urological diseases

Preliminary examination of the urinary sediment
Diagnostic test strips can indicatively detect the presence od erytrocytes, leucocytes or bacteriuria with indirect test on nitrite (tab. 1). If the test with strips is found positive, a more demanding microscopic examination must be performed. However, by using diagnostic test strips the unnecessary microscopic examination can be reduced. Also the strips are used when the cell elements break down due to low osmolality or high urine pH, when the sample is standing for a long time or at higher room temperature. They indicate the presence of disintegrated erythrocytes or leucocytes eventhough the finding of urine sediment is negative. Pseudoperoxidase actvity of hemoglobin or the activity of leucocyte esterases persists for several hours after release from the cells.


 * Tab. 1 Introductory examintation of urinary sediment using diagnostic strips


 * {| class="wikitable FCK__ShowTableBorders"

! Diagnostic strips (reaction zone) ! Microscopic equivalent
 * Blood (hemoglobin/erytrocytes)
 * Erytrocytes, erytrocyte cylinders
 * Leukocytes
 * Leukocytes, leukocyte cylinders
 * Protein
 * Hyaline, waxy, granular cylinders
 * Nitrite
 * Bakteria
 * }
 * Nitrite
 * Bakteria
 * }
 * }

Microscopic examination procedure

 * Urine sample preparation
 * For microscopic examination, is most suitable to take a sample of a middle flow of the first or second morning urine. Usually the second morning urine is recommended because the first morning urine contains broken or damaged cell elements. Also the significant urine osmolality reduction and alkaline pH decreases ocurrence od formed elements due to their lysis.
 * It is necessary to work with fresh urine within 1 hour after collection for examination of urinary sediment. By prolonging the interval between collection and examination, there is higher chance of cell damage and breakdown.
 * The urine sample must be well mixed and then 5 to 10 ml of urine is measured into a test tube. It´s centrifuged at 400g for 5 minutes, preferably at 4°C. Then 9 parts of supernatant are carefully removed which means the sediment is 10 times concentrated compared to the original urine. If we work with a stained sample (see below), we add a dye in an amount that corresponds to 10% of the total volume.


 * Staining procedure
 * 1) Dilute 50 μl of the staining solution (alcian blue and pyronin B in a ration of 1:1) in 0.5 ml of urine sediment and mix gently.
 * 2) After 5 minutes, transfer 13μl  of stained sediment on to the microscopic slide and cover with a coverslip 18x18 mm. A larger volume of stained sample with the appropriate size of coverslip can also be used.
 * First, we view the sample starting with lower magnification of 100-200x so we can assess the distribution of the elements and notice rare particles such as cylinders and epithelial cells. Then we switch the magnification to 400x to count corpuscular elements in at least 10 randomly chosen visual fields. Higher accuracy of element counting is achieved by using a chamber (Bürker or other chamber).

Possibilities of microscopis examination
Bright-field light microscopy and phase contrast techniques are used for microscopic examination of urinary sediment, in special cases also microscopy with polarisation filter can be used.


 * 1) ; Bright-field light microscopy
 * This method enables introductory orientation or identification of pathologic elements. Using bright-field light microscopy for viewing preparation without staining can lead to missing out some elements such as hyaline casts and bacteria. Unstained preparations are harder to identify leucocytes, macrophages and renal tubulars cells. Therefore using supravital staining is recommended for accurate morphological identification of urinary elements because it highlights some details of cellular structure. The term supravital means staining of wet unfixed preparation, in which some cells can still be alive. Nowadays most recommended is Sternheimer´s stain, utilising colored contrast of blue and red provided by Alcian Blue and Pyronine B. The Alcian Blue stains the surface of cells and other elements due to his high affinity to mucopolysaccharides, while Pyronine B stain mostly cytosol by penetrating inside cells.
 * 1) Phase constrast microscopy
 * It´s suitable for rapid evaluation of unstained preparations. By using this method we get more detailed evaluation of sediment, especially better recognition of leucocytes, casts, crystals and differatiation of red blood cells including morphologic alterations of their membranes. Increasing the contrast enables a better display of details archieved by shifting the phase of the light wave of part of the rays.
 * 1) Microscopy with polarisation filter
 * It is suitable for better identification of crystals and lipid bodies.

Components in urinary sediment and their evalution
In the urinary sediment, we assess organ components, mainly represented by cell or cylinders and non-organ components among which we include crystals. Beside that, we try to notice the presence of microorganisms and various artifacts can occur. The main components of urinary sediment are summarized in Table 2.


 * Tab. 2 Overview of the main components of urinary sediment


 * {| class="wikitable FCK__ShowTableBorders"


 * align="center" rowspan="8" |Cellular elements
 * rowspan="4" | blood cells
 * erytrocytes
 * leukocytes
 * lymfocytes
 * macrophages
 * rowspan="3" | epithelia
 * renal tubular cells
 * transitional epithelial cells
 * squamous epithelial cells
 * tumour cells
 * align="center" rowspan="8" | Casts
 * rowspan="4" | cell-free
 * hyaline
 * granular
 * wax
 * fatty
 * rowspan="4" | cellular
 * erytrocytic
 * leukocytic
 * epithelial
 * bacterial
 * align="center" rowspan="4" | Microorganisms
 * bacteria
 * yeast
 * trichomonades
 * mould
 * align="center" | Crystals
 * }
 * fatty
 * rowspan="4" | cellular
 * erytrocytic
 * leukocytic
 * epithelial
 * bacterial
 * align="center" rowspan="4" | Microorganisms
 * bacteria
 * yeast
 * trichomonades
 * mould
 * align="center" | Crystals
 * }
 * yeast
 * trichomonades
 * mould
 * align="center" | Crystals
 * }
 * trichomonades
 * mould
 * align="center" | Crystals
 * }
 * align="center" | Crystals
 * }
 * align="center" | Crystals
 * }
 * }
 * }

Leukocytes

 * Polymorphonuclear granulocytes are the most frequently detected. They are round cells (average size10 μm) with granular cytoplasm. The nucleus is segmentet, but it often undergoes degenerative changes which leads to difficulty of distinguishing it from the cytoplasm. Sometimes it´s poorly stained; if it does stain, it appears disctinctly blue while the cytoplasms is red or red-brown. The appearence of granulocytes is also affected by urine osmolality. They often gather. The finding is characteristic for urinary tract infection, if erytrocytes are present at the same time, it may affect the glomeruli. In around 50% cases we can find leucocytes with bacteria. Eosinophils can be detected only by using special staining. A false positive finding may be caused by contaminated urine (vaginal secretion, failure to follow urine collection instructions - first stream).
 * The occurence of lymphocytes in the urine is mostly associated with chronis inflammation of the kidneys, sometimes with viral infections and further with kidney rejection after transplantation. Lymphocytes have a homogenous nucles with a thin cytoplasmatic margin. The ratio of nucleus to cytoplasms and the smooth tructure of the cytoplasm are best distinguished from renal tubular cells.
 * Sometimes we can also find macrophages. Their finding is relatively common in urinary tract infections.


 * Reference values:
 * ≤ 10 leukocytes/μl urine,
 * approximately &lt; 5 leukocytes/field of view.

Erytrocytes

 * The presence of erytrocytes in the urine is usually a symptom of kidnes or urinary tract disease. Erytrocytes are smaller than leucocytes. They appear as non-nuclear discoid bodies of an average size about 6 μm. In hyperosmolar urine erytrocytes easily lose intracellular fluid, their diameter decreases and they become creped to spiny. On the other hand, in hypoosmolar urine, fluid enters erytrocytes leading to enlarging of cells that may disintegrate. If their hemoglobin content is low, they are difficult to recognise and appear as erytrocyte ghosts.
 * The appearence of urinary red blood cells can indicate their origin. If the glomerular membrane is significantly damaged, then it´s possible not only for proteins but also erytrocytes to penetrate. As the erytrocytes passess through the glomerular membrane, the shape is deformed and the structure changes. Erythrocytes that show deviations from the discoid shape are called dysmorphic. Sometimes they can have the shape of tires (called as ring or annular erythrocytes), other times the membrane of erytrocytes extends into vesicles, in these cases we talk about acantrocytes. Increased occurence of dysmophorphic erytrocytes is typical for renal glomerular involvement. The Zvýšený výskyt dysmorfních erytrocytů je typický pro postižení ledvinných glomerulů. Significant proportion of dysmorphic erythrocytes is distinctive for for affection of kidney glomeruli. If more than 80% of urinary erytrocytes are dysmorphic, it is conlusively a glomerular hematuria, simultaneously a proteinuria is found. If more than 80% of urinary erythrocytes are isomorphic (normal shape), it is a non-glomerular hematuria whose source is bleeding into urinary tract or bleeding from ruptured blood vessels in kidney tumors or urolithiasis. Phase contrast microscopy is required to identify dysmorphic erythrocytes.
 * The casuses of heamaturia must always be clarified, especially cancer or severe glomerulopathy (glomerulonephritis) must be ruled out.
 * The cause of increased number of erythrocytes in the urinary sediment can also be extreme physical exertion, the use of anticoagulants or the admixture of mentrual blood.


 * Reference values:
 * &lt; 5 erythrocytes/μl urine,
 * approximately &lt; 5 erytrocytes/visual field.

Epithelium
They come from the epithelial lining of the renal tubules and urinary tract.


 * Renal tubular cells


 * Their occurence in urinary sediment is always a pathological finding and indicates serious kidney damage, especially for diseases affecting the tubules (acute tubular necrosis, acute interstitial nephritis). They are relatively small cells (average size13 μm) only slightly larger than leucocytes, either round, irregularly polygonal, cubic or faceted with a smooth, usually eccentrically placed (dark blue in the colored sample) round nucleus, without nucleoli. They are characterized by a granular cytoplasm, which appears red in the stained example. They usually occur alone, sometimes they form clusters or casts.
 * In unstained preparation, they are difficult to distinguish from transitional epithelial cells. Therefore sometimes reffered to as "small round epithelial cells" in laboratory practice. They can also be mistaken for leucocytes.


 * Transitional epithelial cells
 * They originate from the superficial or deeper layers of the transitional epithlelium lining of the urinary tract. It is not possible to locate them in certain part of the urogenital tract. A common finding are surface layer cells that are round or ovoid with a round or ovoid nucleus located centrally or sligthtly eccentrically with a visible nucleolus and a cytoplasm that is usually granulated (less tan tubular cells), the granulation is usually on the periphery of the cell, rarely around the core. The average size is around 30 μm). Finding of these cells usually indicates an infection in the lower urinary tract, especially if leucocytes are also found. However, they can come even in urine of healthy inviduals.
 * Cells from deeper layers are smaller (average size 17 μm), ovouid and their shape is much more variable (shape of clubs, hammers or cells with tails). Dual-nuclear cells are commonly found. We encounter them in the urine of patients with urothelial carcinomas or urinary stones.


 * Dlaždicové epitelie
 * Jsou největší buňky v močovém sedimentu (průměrná velikost 55 μm), obdélníkovitého až polygonálního tvaru s malým jádrem a bohatou cytoplazmou. Pocházejí většinou z uretry, případně z vaginy a jejich množství závisí na kvalitě provedeného odběru vzorku moči. Nacházejí se obvykle v moči žen při špatném kontaminovaném odběru, nemají diagnostický význam.

Nádorové buňky

 * Nádorové buňky se mohou uvolňovat do moči u nádorů ledvin, vývodných cest močových a přídatných orgánů (např. prostaty). Je pro ně typický nepravidelný tvar jádra, které je v poměru k cytoplazmě zpravidla zřetelně větší. Bez barvení je přítomnost nádorových buněk obtížně prokazatelná (tab. 3).


 * Tab. 3 Základní morfologická charakteristika buněk močového sedimentu

580px|Určování buněčných elementů v močovém sedimentu (podle Kouri T. et al. 2000)

Válce
Válce jsou útvary cylindrického tvaru, vznikající v distálních tubulech a sběrných kanálcích ledvin. Matrix je tvořena Tamm-Horsfallovým proteinem, který je produkován tubulárními epiteliálními buňkami, jejichž povrch chrání. Za určitých okolností, jako je nízké pH, vysoká osmolalita, vysoké koncentrace proteinů, může Tamm-Horsfallův protein precipitovat a vytvářet odlitky tubulů, které jsou uvolňovány do moči. Při mikroskopickém vyšetření jsou popisovány jako válce. Do matrix válce se během precipitace může zabudovat i další materiál, např. buněčné elementy (leukocyty, erytrocyty, renální buňky), pigmenty (hemoglobin, bilirubin), krystaly a plazmatické bílkoviny. Válce jsou jediné elementy, které jsou vždy renálního původu, nemohou pocházet z vývodných cest močových. Morfologie válců závisí na průměru tubulů, ve kterých se utvářejí. V případě, že tubulus, v němž válec vzniká, je rozšířen v důsledku atrofie nebo obstrukce, vytvářejí se široké válce, typické pro selhání ledvin.

Podle vzhledu se válce klasifikují na:


 * bezbuněčné
 * hyalinní,
 * granulované,
 * voskové,
 * tukové;


 * buněčné (plocha válce je z více než 1/3 pokryta buňkami)
 * erytrocytové,
 * leukocytové,
 * epitelové,
 * bakteriální.

Průkaz buněčných válců v močovém sedimentu je vždy známkou patologického procesu v ledvinách (tab. 4).


 * Tab. 4 Přehled a diagnostický význam jednotlivých typů válců v močovém sedimentu'

Mikroorganismy

 * Bakterie
 * Za fyziologických okolností obsahuje moč bakterie v množství menším než 105/ml. Mají vzhled malých kokovitých nebo tyčinkovitých útvarů, které se od ostatních elementů liší.
 * Přítomnost bakterií může být také známkou nesterilně odebrané moči, neboť bakterie se při delším stání vzorku rychle množí.


 * Trichomonády
 * Mají kruhovitý nebo oválný tvar s bičíky, vyznačují se rychlým nepravidelným pohybem, pokud jsou živé. Jejich častý nález je u současně probíhajícího zánětu pochvy.


 * Kvasinky
 * Jsou o něco menší než erytrocyty, oválné, ale různě velké. Nacházíme je ve skupinách a někdy se seskupují ve formě řetízků. Jsou častým nálezem u diabetiků, u nemocných léčených imunosupresivními preparáty a někdy i po podávání antibiotik.

Krystaly
Vyšetření krystalů je nutno provádět v ranní moči ihned po jejím odběru. Nález krystalů, které se v močovém sedimentu vyskytují poměrně často, nelze přeceňovat. Výskyt krystalů může být následkem přechodného přesycení moči, např. při příjmu potravy bohaté na uráty nebo oxaláty, a je signálem pro zvýšení příjmu tekutin. In vitro dochází k vytvoření krystalů při ochlazení vzorku moči nebo při změnách pH. Nález krystalů za těchto okolností je klinicky nevýznamný.


 * Častý je nález krystalů kyseliny močové a amorfních urátů v kyselé moči a fosforečnanu amonno-hořečnatého v alkalické moči při infekci močových cest.
 * Detekce krystalů je významná u pacientů s urolitiázou. Jejich průkaz může naznačit, o jaký druh konkrementů se jedná. Z nálezů krystalů v moči nelze však činit závěry, že v močových cestách je konkrement stejného chemického složení. Opakovaný průkaz krystalů má význam zejména při kontrole pacientů po odstranění konkrementu nebo u pacientů s recidivou urolitiázy.
 * Identifikace šestibokých krystalů cystinu podpoří diagnostiku cystinurie.
 * Nález krystalů fosforečnanu amonno-hořečnatého společně s vysokým pH moči ukazuje na pravděpodobnost struvitových konkrementů.
 * Záplava krystalů šťavelanu vápenatého je charakteristickým nálezem u otravy ethylenglykolem, jinak jsou tyto krystaly častým nálezem zejména u osob s vyšším příjmem rostlinné stravy a nemají vztah k tvorbě konkrementů. Jiným příkladem jsou krystaly kyseliny močové u urátové nefropatie.
 * Přítomnost krystalů leucinu a tyrosinu doprovází těžké onemocnění jater. Také některé léky mohou být vylučovány ve formě krystalů, zejména při předávkování, dehydrataci nebo hypoalbuminemii. Vliv má i pH moči v závislosti na povaze léku.
 * Cholesterolové krystaly jsou známkou těžkého poškození glomerulární membrány (tab. 5).


 * Tab. 5 Vybrané krystaly v močovém sedimentu

Lipidy

 * Lipidy mohou pronikat do moči porušenou glomerulární membránou ve formě plazmatických lipoproteinů. Lipoproteinové částice jsou větší než samotné bílkoviny, a proto je lipidurie spojena s těžkou proteinurii a signalizuje závažné poškození ledvin.
 * Lipidy se vyskytují ve formě volných kapének izolovaných nebo ve shlucích; v tomto případě jejich přítomnost může být vyvolána kontaminací, např. čípky. Intracelulárně lokalizované tukové inkluse jsou známkou degenerativních změn buněk. Další formou jsou cholesterolové krystaly nebo tukové válce.

Další nálezy

 * V močovém sedimentu můžeme dále zaznamenat pohyblivé spermie s dlouhým tenkým bičíkem, hlenová a fibrinová vlákna a různé kontaminující útvary, jako jsou vlákna toaletního papíru nebo různých textilií.

Kvantitativní vyšetření močového sedimentu podle Hamburgera
V indikovaných případech lze provádět kvantitativní vyšetření močového sedimentu podle Hamburgera, pomocí něhož se sleduje rychlost, s jakou jsou do moči vylučovány erytrocyty, leukocyty a válce. Pacient sbírá moč 3 hodiny. V krajním případě se toleruje odchylka ±30 minut, kterou je třeba vzít v úvahu při výpočtu. Po skončení sběru se do 1 hodiny do laboratoře dodá celý objem nasbírané moči. Zároveň je nezbytné udat s přesností na minuty dobu sběru. V sedimentu se hodnotí počet erytrocytů, leukocytů a válců v 5 velkých čtvercích Bürkerovy komůrky.


 * Referenční hodnoty:


 * Erytrocyty do 2000/min, tj. 33 Er/s.
 * Leukocyty do 4000/min, tj. 67 Leu/s.
 * Válce do 60–70/min, tj. 1 válec/s.

Automatická analýza močového sedimentu
V současnosti jsou dostupné přístroje pro automatizované vyšetření močového sedimentu. Pracují na principu průtokové cytometrie nebo digitálního snímání částic.

Průtoková cytometrie
Průtoková cytometrie je laboratorní metodou, která umožňuje současné měření řady parametrů u velkého množství částic. Vedle hematologie se postupně začíná rozšiřovat její uplatnění při vyšetření močového sedimentu, které až dosud významně zatěžovalo laboratoře a kromě toho bylo zatíženo subjektivní chybou. Při průtokové cytometrii jsou částice označovány různými fluorofory a poté je buněčná suspenze hnána úzkou kapilárou. Při průchodu kapilárou se částice setkávají s paprskem světla, obvykle z laseru, který vybudí fluorescenci fluoroforů. Světlo laseru je buňkou rozptylováno. Nejčastěji měřenými parametry jsou rozptyl světla pod malým úhlem, který je přímo úměrný velikosti buněk – tzv. forward scatter, rozptyl světla do velkého úhlu tzv. side scatter, který poskytuje informaci o vnitřní struktuře částic, a fluorescence různé vlnové délky. Průtokový cytometr je plně automatizovaný analyzátor pro analýzu a identifikaci buněk a dalších elementů nativních močových vzorků.


 * Postup analýzy:
 * Při vyšetření močového sedimentu průtokovou cytometrií je moč po promíchání nasáta (0,8 ml), naředěna a je změřena vodivost.
 * Následuje automatické obarvení močových elementů dvěma odlišnými fluorescenčními barvivy. Fenanthridinové barvivo barví nukleové kyseliny (oranžová fluorescence). Druhé používané barvivo – karbocyanin je určen k nabarvení negativně nabitých buněčných membrán, jaderných membrán a mitochondrií (zelená fluorescence).
 * Obarvené částice procházejí kapilárou a jsou ozářeny laserovým paprskem, který je buňkou jednak rozptýlen a jednak je vybuzena fluorescence fluoroforů. Současně se měří elektrická vodivost částic v kapiláře. Identifikace a počítání elementů je umožněno hodnocením fluorescence obou barviv společně s měřením rozptylu záření emitovaným laserem a naměřenou vodivostí.

Pomocí průtokového cytometru lze diagnostikovat všechny buněčné elementy – erytrocyty, leukocyty, bakterie a epitelové buňky. Kromě toho je schopen diferencovat některé klinicky významné modifikace jako jsou izomorfní a dysmorfní erytrocyty. Poskytuje informaci o přítomnosti patologických válců, které je však zapotřebí dále mikroskopicky vyšetřit. Prokazuje rovněž krystalické struktury, ale nerozliší jednotlivé typy krystalů, i v tomto případě je zapotřebí mikroskopické upřesnění. Průtokový cytometr není schopen diferencovat trichomonády. Počet erytrocytů, leukocytů, bakterií, plochých epitelií a válců je udáván v počtu elementů/μl. Pro zvýšení správnosti analýzy močového sedimentu je možno automaticky porovnat výsledky chemické analýzy pomocí diagnostických proužků, která je vyhodnocována reflexním fotometrem, a analýzy průtokovou cytometrií, tzv. cross-check. Shoda průtokové cytometrie s mikroskopií se pohybuje v rozmezí 80–90 %, shoda s diagnostickými proužky v 72–96 %. Průtoková cytometrie výrazně snižuje nutnost mikroskopických analýz, zlepšuje přesnost měření a usnadňuje standardizaci výsledků.

Digitální snímání částic
Při tomto způsobu automatické analýzy močového sedimentu je vzorek necentrifugované moči vháněn do planární kyvety. Částice přítomné v moči jsou mnohonásobně snímány pomocí digitální kamery a jejich snímky jsou porovnávány na základě jejich velikosti, tvaru a struktury s databází, která je součástí software přístroje.

Video k automatické analýze moči můžete shlédnout zde.

Referenční hodnoty vyšetření moči

 * Chemické vyšetření
 * pH 5–7.
 * Relativní hustota 1,016–1,022.
 * Bílkovina do 0,3 g/l.
 * Glukosa negativní.
 * Ketolátky negativní.
 * Bilirubin negativní.
 * Urobilinogen 3,2–16 μmol/l.
 * Krev do 5/μl.
 * Leukocyty do 10/μl.
 * Dusitany negativní.


 * Sediment (kvantitativně)
 * Erytrocyty &lt; 33/s.
 * Leukocyty &lt; 67/s.
 * Válce &lt; 1/s, jen hyalinní.

Related articles

 * Interpretace nálezů v močovém sedimentu
 * https://www.wikiskripta.eu/w/Vy%C5%A1et%C5%99en%C3%AD_mo%C4%8Di
 * https://www.wikiskripta.eu/w/Vy%C5%A1et%C5%99en%C3%AD_mo%C4%8Di/Mikroskopick%C3%A9