Biochemical examination of cerebrospinal fluid

Cerebrospinal fluid testing is one of the basic methods that contribute to the diagnosis of neurological diseases. The cerebrospinal fluid is most often removed by lumbar puncture (3×5 ml, between L4–L5 or S1), the suboccipital approach is less common. The cerebrospinal fluid needs to be transported to the laboratory as quickly as possible, as the cells gradually break down, the glucose concentration decreases and the lactate increases.

Color
Under physiological conditions, cerebrospinal fluid is a clear, colorless liquid. If there are colored substances in the cerebrospinal fluid, it is a pathological condition. It is usually conditioned by the presence of hemoglobin, methaemoglobin and bilirubin.
 * The admixture of blood causes a pinkish to red coloration, referred to as erythrochromic (sanguinolent). Blood can enter the cerebrospinal fluid artificially by injuring blood vessels during lumbar puncture. If the cerebrospinal fluid is collected in three test tubes during collection, then in this case the color of the liquid in the test tubes weakens and after centrifugation the cerebrospinal fluid is colorless. In intracranial hemorrhage, the staining is the same intensity in all tubes. During fresh bleeding, the supernatant is also colorless. The yellow, xanthochromic coloration of the cerebrospinal fluid is due to the presence of bilirubin caused by hemoglobin conversion. Xantochromy may persist 3–4 weeks after the onset of bleeding (seecerebrospinal fluid spectrophotometry below).


 * The presence of methaemoglobin shows an ocher yellow to brown color.

Turbidity
Cerebrospinal fluid turbidity is usually caused by leukocytes, which are present in cerebrospinal fluid in purulent neuroinfections. The intensity of turbidity corresponds to the number of leukocytes. The admixture of erythrocytes can also manifest itself in turbidity.

Proteins in the cerebrospinal fluid
Z klinického hlediska má význam zvýšená koncentrace celkové bílkoviny v mozkomíšním moku, tzv. hyperproteinorachie, která může být způsobena několika mechanismy:
 * Patologické změny proteinorachie:
 * Při poruše hematolikvorové bariéry do likvoru patologicky proniká větší množství bílkovin. Při blokádě likvorových cest dochází pod překážkou k těžké poruše hematoencefalické bariéry a do moku pronikají bílkoviny z plazmy (albumin i vysokomolekulární fibrinogen).
 * Intratékální syntéza imunoglobulinů při aktivaci imunitního systému.
 * Abnormální složení plazmatických bílkovin se promítne do složení likvorových proteinů, např. monoklonální gamapatie se projeví přítomností stejných imunoglobulinů i v likvoru.
 * Zvýšení strukturálních proteinů při poškození tkáně CNS.
 * Nádorová infiltrace mozkových obalů.

Stanovení celkové bílkoviny v mozkomíšním moku se uplatňuje především jako rychle proveditelné vyšetření, které poskytuje základní informaci o stavu hematolikvorové bariéry.


 * Metody stanovení bílkoviny v mozkomíšním moku:


 * Jednou z doporučených metod pro kvantitativní stanovení celkové bílkoviny v mozkomíšním moku je reakce s pyrogallolovou červení.


 * Orientačně lze kvalitativně zvýšené množství bílkoviny v mozkomíšním moku prokázat Pandyho reakcí, při níž jsou denaturovány globuliny a částečně i albumin vodným roztokem fenolu.


 * Referenční hodnoty:
 * Sp-Celková bílkovina (proteinorachie): 0,20–0,45 g/l
 * Pandyho reakce: negativní < 0,2 g/l proteinu

Albumin v mozkomíšním moku
Albumin v likvoru pochází vždy z krve, neboť v CNS se netvoří. Jeho syntéza probíhá v játrech a do mozkomíšního moku se dostává přestupem přes hematolikvorovou bariéru. Zastoupení albuminu tvoří asi 57 % celkové bílkoviny v CSF. Zvýšená koncentrace albuminu v likvoru je vždy známkou poruchy hematolikvorové bariéry.

Pro přesnější zhodnocení jejího stavu se používá tzv. albuminový kvocient Qalb, který bere v úvahu koncentraci albuminu v mozkomíšním moku (AlbCSF) a séru (Albsérum):


 * $$Q_{alb} = \frac{Alb_{CSF}}{Alb_{s\acute{e}rum}} $$


 * Albuminový kvocient se využívá:
 * K hodnocení míry postižení hematolikvorové bariéry;
 * Pro výpočet intratékální syntézy imunoglobulinů.


 * Patologické hodnoty albuminového kvocientu:
 * Zvýšení Qalb nacházíme u porušené hematolikvorové bariéry, s kterou se setkáváme u zánětlivých onemocnění CNS (meningitidy různého původu), roztroušené sklerózy nebo při obstrukci v likvorových cestách.


 * Metody stanovení albuminu:


 * Albumin se v CSF stanovuje citlivými imunochemickými metodami (imunoturbidimetrie, imunonefelometrie, ELISA).


 * Referenční hodnoty:
 * Sp-Albumin: 		120–300 mg/l
 * Albuminový kvocient – Qalb (je závislý na věku):
 * do 15 let: ≤ 5×10−3
 * do 40 let: ≤ 6,5×10−3
 * do 60 let: ≤ 8×10−3

Imunoglobuliny v mozkomíšním moku
Imunoglobuliny v likvoru mohou pocházet buď z krve, nebo vznikají intratékálně. Intratékální syntéza protilátek probíhá v perivaskulárně uložených B-lymfocytech, které se diferencují v plazmocyty.


 * Patologické změny koncentrace imunoglobulinů:

Zvýšení koncentrace imunoglobulinů v likvoru může být způsobeno:
 * Poruchou hematolikvorové bariéry;
 * Zvýšenou intratékální syntézou;
 * Zvýšenou koncentrací imunoglobulinů v séru;
 * Poruchou cirkulace likvoru.


 * Metody stanovení imunoglobulinů:

Jednotlivé třídy imunoglobulinů se stanovují citlivějšími imunochemickými metodami jako je imunoturbidimetrie, imunonefelometrie a ELISA.

Referenční hodnoty:


 * Koncentrace imunoglobulinů v mozkomíšním moku:
 * Sp-IgG: 	12,0–40,0 mg/l
 * Sp-IgM:	  0,2–1,2 mg/l
 * Sp-IgA:	 0,2–2,1 mg/l

Průkaz intratékální tvorby imunoglobulinů
Pouhé stanovení koncentrace imunoglobulinů v likvoru je nedostačující, neboť pro diferenciálně diagnostické účely je zapotřebí odlišit intratékální nebo krevní původ imunoglobulinů. K tomu se používá výpočet různých indexů, rovnic či hodnocení pomocí grafů.

Imunoglobulinový index

 * Orientační informaci nám poskytne imunoglobulinový index. Hodnotí imunoglobuliny a albumin v séru a v likvoru. Pro jeho výpočet je zapotřebí v likvoru a současně v séru stanovit koncentrace obou analytů. Vypočítá se na základě kvocientu příslušného imunoglobulinu (IgG, IgA, IgM) a albuminového kvocientu.


 * $$IgG_{index} = \frac{Q_{IgG}}{Q_{alb}} $$


 * $$IgG _{index} = \frac{IgG_{CSF}/IgG_{s\acute{e}rum}}{Alb_{CSF}/Alb_{s\acute{e}rum}} $$


 * Referenční hodnoty:


 * Imunoglobulinový index IgG:
 * IgG index: 	< 0,5 nesvědčí pro intratékální syntézu IgG
 * IgG index: 	0,5–0,75 nevylučuje intratékální syntézu IgG
 * IgG index: 	> 0,75 svědčí pro intratékální syntézu IgG

Reiberův diagram
250px|thumb|Obr. 3: Reiberův diagram Reiberův diagram umožňuje rychlý průkaz intratékální syntézy imunoglobulinů. Vynášejí se do něho vypočítané hodnoty QAlb a QIgG. Podle umístění vynesené hodnoty v grafu lze určit původ imunoglobulinů a poruchu hematolikvorové bariéry.


 * Hodnocení:

Reiberův diagram (obr. 3) je rozdělen do 5 oblastí, které vymezují nálezy:
 * Oblast 1 – normální nález;
 * Oblast 2 – izolovanou poruchu hematolikvorové bariéry bez lokální syntézy Ig oblast 2;
 * Oblast 3 – poruchu hematolikvorové bariéry společně s intratékální syntézou Ig oblast 3;
 * Oblast 4 – izolovaná intratékální syntéza Ig bez poruchy hematolikvorové bariéry;
 * Oblast 5 – oblast analytických chyb.

Hranice mezi lokální syntézou imunoglobulinů a jejich pasivním přestupem je znázorněna modrou čárou. Hodnoty nad touto linií znamenají intratékální syntézu a rozsah je vyznačen přerušovanou čárou a vyjádřen v procentech. Vertikální přerušovaná čára odděluje normální a porušenou hematolikvorovou bariéru.

Oligoklonální imunoglobuliny v mozkomíšním moku
Nejcitlivější metodou pro průkaz intratékální syntézy protilátek je stanovení oligoklonálních imunoglobulinů metodou izoelektrické fokusace s následným barvením nebo imunofixací nebo imunoblottem. Fyziologicky mají imunoglobuliny v séru i mozkomíšním moku polyklonální charakter a vyjadřují heterogenitu individuálních protilátek produkovaných jako odpověď na nejrůznější antigeny, s nimiž se jedinec setkal.

Předpokládá se, že do CNS vstupuje pouze omezený počet B-lymfocytů, které se po aktivaci antigenem (např. určitým mikroorganismem nebo autoantigenem) diferencují v plazmatické buňky secernující protilátky. Intratékálně produkované protilátky se vyznačují pouze omezenou (oligoklonální) heterogenitou, což se při izoelektrické fokusaci projeví jako izolované proužky, které nejsou patrné při analýze séra. Z toho vyplývá nutnost provádět současně analýzu imunoglobulinů likvoru i séra. Srovnává se přítomnost či nepřítomnost identických pruhů IgG v séru a moku; počet a lokalizace proužků nemá diferenciálně diagnostický význam.

Hodnocení:

Popisuje se pět různých typů  izoelektroforegramů (obr. 4): náhled|260x260pixelů|Obr. 4: Základní typy izoelektroforegramů mozkomíšního moku
 * Type 1 – v séru i v moku pouze polyklonální IgG – normální nález;


 * Type 2 – oligoklonální proužky pouze v likvoru – lokální syntéza IgG (např. u roztroušené sklerózy);


 * Type 3 – oligoklonální proužky v likvoru a další oligoklonální proužky v likvoru i v séru – lokální syntéza IgG a produkce protilátek v organismu (např. chronická infekce CNS, roztroušená skleróza);


 * Type 4 – identické oligoklonální proužky v séru i moku (tzv. „zrcadlový“ obraz proužků v éru a v likvoru – dochází k průniku protilátek z krve do likvoru) – systémová imunitní aktivace bez lokální syntézy IgG v CNS;


 * Type 5 – identické monoklonální proužky v séru i moku v krátkém úseku pH gradientu, jde o přítomnost monoklonálního paraproteinu v likvoru sérového původu (myelom, monoklonální gamapatie) – paraproteinový obraz.

Glucose in the cerebrospinal fluid
Glucose, which is the main energy substrate for nerve tissue, is transported to the brain through the transport systems in the chorioid plexus. The concentration of glucose in the cerebrospinal fluid is determined by the capacity of the transporter systems, utilization in the nervous tissue and the rate of reabsorption in the cerebrospinal fluid. Glucose concentration in the cerebrospinal fluid – glycorachia monitors the concentration of glucose in the blood.

Thherefore, for the evaluationbof glycorachia, it is necessary to simultaneously determine the concentration in lthe cerebrospinal fluid and in the blood and calculate their Qglu quotient from the values (glycocharia / glycemia ratio) similarly to albumin or immunoglobulins:


 * $$Q_{glu} = \frac{Glu_{CSF}}{Glu_{s\acute{e}rum}} $$

Under physiological conditions, the ratio of glycorachia to glycemia is about 0,6;
 * A value below 0,45 is considered pathological.

Pathological changes of glycorachia and Qglu:


 * We encounter increased glycorachia – hyperglycorachia in diabetics.


 * Decreased values of glycorachia – hypoglycorachia (after excluding hypoglycaemia), which occur in the cerebrospinal fluid with a higher number of cells are important for diseases of the nervous system. Hypoglycorachia is demonstrated in bacterial meningitis, where it is explained by glucose consumption by bacteria and leukocytes (Qglu <0.4). It can drop to zero values. Successful treatment leads to a return of glycorachia to normal.
 * Other causes of reduced cerebrospinal fluid glucose may be CNS cancer, where glucose is used by tumor cells, and cerebral ischemia, where oxygen deficiency limits aerobic glycolysis and requires more glucose to meet energy requirements with anaerobic glycolysis.
 * In subarachnoid hemorrhage, erythrocytes contribute to the increased glucose requirement.
 * In subarachnoid hemorrhage, erythrocytes contribute to the increased glucose requirement.
 * In subarachnoid hemorrhage, erythrocytes contribute to the increased glucose requirement.

Method for determination of glycorachia:


 * Methods for determining the concentration of glucose in cerebrospinal fluid are similar to those for determination in blood (plasma), ie. peroxidase or hexokinase reaction. If it is not possible to examine glucose within 30 minutes of collection, the cerebrospinal fluid should be stored on ice or sodium fluoride added to prevent undesired glucose loss due to glycolysis. It takes place in microorganisms, leukocytes or tumor cells, which may be part of the fluid under pathological conditions.

Reference values: 
 * Sp-Glucose:	2,2–4,2 mmol/l
 * Qglu: 	0,6

Lactate in the cerebrospinal fluid
Lactate is formed by the breakdown of glucose by glycolysis under anaerobic conditions. A certain amount of lactate is physiologically produced in the brain tissue, which reflects the metabolic activity of the brain. It practically does not cross the blood-brain barrier and its concentration, unlike glucose, does not depend on the plasma concentration. CSF lactate levels have the opposite trend than glucose levels.

Determination of lactate in CSF is a more sensitive indicator than determination of glucose. Lactate is an important parameter that helps to distinguish between meningitis of bacterial and viral origin.

Pathological changes in lactate:


 * Elevated lactate levels in bacterial meningitis are a manifestation of anaerobic glycolysis of bacteria and, to a lesser extent, leukocytes. With effective therapy, lactate decreases.
 * All disorders of the brain's oxygen supply (eg anoxia, hypoxia, eg in stroke) due to increased anaerobic glucose metabolism are accompanied by increased lactate levels.
 * In subarachnoid hemorrhage, the rise in lactate is caused by erythrocytes present in the cerebrospinal fluid, which also cover energy requirements by anaerobic glycolysis (they do not have mitochondria).
 * It is also increased in malignant infiltration of the meninges and in some metabolic diseases (mitochondrial encephalomyopathy).

Methods for determination of lactate:

Enzyme spectrophotometric methods based on the Warburg optical test principle are used.

Reference values: 
 * Sp-Lactate: 1,2–2,1 mmol/l

Chlorides in the cerebrospinal fluid
The chloride concentration in the cerebrospinal fluid is normally 124 mmol/l.
 * A decrease below 100 mmol/l together with a decrease in glucose indicatestuberculosis or fungi.

Related articles

 * The cerebrospinal fluid
 * Proteins in cerebrospinal fluid
 * Cerebrospinal fluid spectrophotometry
 * Cytological examination of cerebrospinal fluid
 * Cerebrospinal fluid syndromes