Cholinesterase

We distinguish between acetylcholinesterase (ACHS), which selectively hydrolyzes acetylcholine, is produced at synapses of cholinergic nerves and in neuromuscular junctions, and is contained in erythrocytes; and between a related enzyme, sometimes referred as ``pseudocholinesterase'', which also cleaves other choline esters. It is produced in the ribosomes of liver cells and is secreted into the bloodstream. A reduction in CHS activity in the blood serum is considered pathological. ACHS is sometimes measured in the amniotic fluid when looking for congenital hereditary defects.

Testing
To test the activity of ACHS, the substrate used is mostly ``butyrylthiocholine iodide, which ACHS cleaves into butyrate and ``thiocholine iodide, which further reacts with 5,5´-dithiobis-2-nitrobenzoic acid to form a colored substrate named 5-mercapto-2 nitrobenzoate, measurable at 410 nm, or thiocholine iodide reduces Fe2+ and the decrease in absorbance is measured at 405 nm. The test is performed on non-hemolytic serum or on blood plasma with an addition of heparin or EDTA. ACHS activity is stable in serum for up to 17 days at 4 °C, and up to 3 months at −20 °C.

Evaluation
Possible causes of the ""reduction"" of activity in the serum can be proteosynthesis disorder in severe hepatopathy, but also protein malnutrition (chronic starvation, tumor cachexia). The reduction can also be caused by intoxication with organophosphates, which are non-competitive inhibitors of this enzyme (chemical warfare agents, but also some insecticides). An inherited defect in cholinesterase synthesis is clinically silent in familial idiopathic acholinesterasemia, but there is a risk of an apneic pause due to cholinesterase deficiency after succinylcholine (a muscle relaxant) is given.

An "increase" in serum activity occurs, for example, in patients with increased proteosynthesis in nephrotic syndrome, in the recovery phase after hepatitis, in alcoholism, and in some other conditions. It has no diagnostic value. In patients with myasthenia gravis, autoantibodies directed against acetylcholine receptors are found in the serum; the symptoms of the disease are caused by an insufficient response to acetylcholine, i.e. muscle weakness to paresis. Among other things, cholinesterase inhibitors are used as the therapy of this condition.

ACHS physiological values at 37 °C are 87-140 µkat/l for children up to 15 years, 66.7-210.4 µkat/l for men and 85.2–195.4 µkat/l for women.

History
The existence of enzymes that can hydrolyze the neurotransmitter acetylcholine (ACh) was predicted in 1914 (Dale), before the actual discovery of the enzymes, as a result of an animal response to ACh administration. In 1926, a Calabar bean alkaloid (a poison that paralyzes the central nervous system, previously used in witchcraft), which was used in biochemistry as an inhibitor, has further demonstrated the existence of cholinesterase. In 1940, 2 main forms of ChE were discovered (Alles and Hawes). The two main closely related hydrolases from this family have been named acetylcholinesterases. Both enzymes are type B carboxypeptidases due to their biochemical properties. Both enzymes also exist in multiple molecular forms, both are ubiquitously distributed. AChe is more tissue specific than BChE. Both are sensitive to organic inhibition. In mammals, AChE and AChB have a strong primary homologous structure. Although the structure of ChEs has been studied for over 75 years, many characteristics are still unknown.

Cholinesterase and dementia treatment
In mild and moderate forms of dementia, cholinesterase inhibitors may be indicated, which is used in Alzheimer's disease therapy. Of course, there are patients who tolerate the treatment well and those who aren't responsive. Individual variability can be caused by the form of the disease, diagnostic inconsistencies, abnormalities in the metabolism of acetylcholine and other physical and mental comorbidities, or morphological changes of the CNS.

The principle of treatment is to affect the acetylcholinergic system by administering cholinesterase inhibitors, administering acetylcholine precursors, administering nicotinic and muscarinic agonists receptors, influencing the acetylcholinergic system by other mediators' pathways and some other mechanisms.

One of the most successful therapeutic methods is the application of cholinesterase inhibitors (IChE).

Side effects
The nature of the side effects varies depending on the stage of treatment in which the inhibitors are administered. During the titration phase of treatment (acute), the basic titration interval for IChE administration is four weeks. Titration is necessary with rivastigmine and galantamine in order to reduce the incidence of gastrointestinal side effects. Titration is not necessary for donepezil. Acute adverse effects and side effects are identical for the entire IChE group, therefore they are also referred as "class-effects". These effects are caused by an increased central cholinergic activity in the area postrema of the hypothalamus. Gastrointestinal side effects seem to be dominant in this phase. Side effects in this phase of treatment can be reduced, for example, by increasing the dose gradually (i.e. titration). If being administered with food or shortly after eating, we can achieve a significant reduction of possible adverse effects. Male patients and patients with higher body mass tend to have a lower incidence of acute side effects. More serious stages of the disease are usually accompanied by a lower incidence of side effects. The increase occurs when titration is neglected, the medication administered on an empty stomach, in female patients, in milder stages of the disease and also in vascular dementia. The simultaneous administration of drugs blocking the hepatic metabolism of IChE is also a risk.

Long-term treatment phase
V této fázi se nežádoucí a vedlejší účinky liší pro jednotlivé IChE. Liší se tím, že se na jejich výskytu uplatňuje kromě centrální i periferní cholinergní aktivita, významný vliv má také blokáda jednotlivých izoforem cholinesteráz, především G1, G2 a G4. Jednotlivé izoformy se liší chemickou stavbou a topografickým rozmístěním v CNS i na periferii. Nejdůležitější je blokáda izoformy G1. Ta se nachází v kortexu, hypokampu a amygdale, tedy v těch oblastech CNS, které jsou pro rozvoj AD nejdůležitější. Masivní blokáda je terapeuticky žádoucí, má ale za následek vyšší četnost gastrointestinálních nežádoucích účinků v akutní fázi léčby, zejména při rychlém zvyšování dávky. Méně specifický terapeutický efekt má blokáda G4 izoformy. Ta se díky vyššímu zastoupení v medulla oblongata, mozkovém kmeni a nucleus caudatus uplatňuje rovněž v ovlivnění spánku, na vzniku možných kardiovaskulárních nežádoucích účinků a případně extrapyramidových efektů. G2 forma je lokalizována převážně periferně. Vliv na kognitivní funkce je relativně malý, negativně se může uplatnit v rozvoji nežádoucích muskulárních účinků.

Farmakokinetické a farmakodynamické problémy při léčbě inhibitory cholinesteráz
Nemocní s AD jsou většinou vyššího věku a mají často ještě další chronické nemoci, hlavně tělesné. Také dochází k lékovým interakcím, protože nemocní užívají řadu léků rozdílných farmakologických vlastností. Např. donepezil může způsobit metabolické interakce, ale má vhodně dlouhý poločas, tudíž poskytuje dobrou stabilitu hladin. U galantaminu se také uvádějí metabolické interakce, má kratší poločas, tudíž kolísání hladin. Užívají se inhibitory CYP 450 a induktory tohoto enzymu. Při léčbě IChE dochází k posílení cholinergního přenosu nejen v klinicky žádoucích, ale i v dalších oblastech CNS a periferních orgánech. U kardiovaskulárního ústrojí může dojít k bradyarytmii, v gastrointestinálním traktu k nauzee, dyspepsii a průjmu. V respiračním systému může dojít k bronchokonstrikci. I přes tato rizika jsou IChE léky bezpečné, je však důležité léčbu monitorovat, protože každý pacient se s ní vypořádá jinak.

Biologické monitorování
S cholinesterázou také souvisí biologické monitorování, což je stanovení sledované chemické škodliviny nebo jejích metabolitů přímo v organismu. K vyšetření se používá moč, stolice, vydechovaný vzduch, vlasy nebo sliny. Stanovovaná látka se nazývá biomarker expozice. Chemická škodlivina může narušit normální biochemické pochody v organismu a to se projeví změnou hladin fyziologicky se vyskytujících látek v moči nebo krvi. Příkladem je právě cholinesteráza, která je zodpovědná za přenos nervových vzruchů. Pokud se člověk setká s organofosfátovými insekticidy, vede to k inhibici a poklesu aktivity cholinesterázy.

Metody analýzy
S biologickým materiálem se často provádí extrakce, nakoncentrování a převedení na snáze analyzovatelnou formu. Vzorky na analýzu kovů se před měřením mineralizují. Využívá se metod chromatografických a to hlavně plynové chromatografie s univerzálním plamenoionizačním detektorem, případně se selektivním detektorem pro dusíkaté látky nebo detektorem elektronového záchytu pro sloučeniny s atomy halogenů a HPLC s UV detektorem. Pro stanovení kovů se využívá AAS a hmotnostní spektrometrie.