Biochemical Examination in Hyperlipoproteinemia

Problematika poruch lipidového metabolismu se v posledních letech dostává do popředí zájmu především v souvislosti s prevencí a léčbou kardiovaskulárních onemocnění. Podstatnou úlohu v diagnostice hyperlipoproteinémií a sledování terapie mají biochemická vyšetření.

Základním laboratorním vyšetřením je stanovení celkového cholesterolu a triacylglycerolů v séru (plazmě), dále stanovení LDL- a HDL-cholesterolu.

K dalším již specializovanějším vyšetřením patří stanovení typických apoproteinů apoA-I (HDL) a apoB-100 (LDL), popř. i lipoproteinu(a) a elektroforéza lipoproteinů, jejíž význam se snižuje. Postupně se rozvíjí i DNA diagnostika, postihující příčiny některých HLP.

Laboratorní diagnostika poruch lipidového metabolismu se musí opírat o vyšetření krevních lipidů alespoň ze dvou odběrů krve v rozmezí 2–8 týdnů, za běžného životního stylu. U jednotlivých parametrů se zjistí rozdíly a pokud jsou nižší než přípustné hodnoty, vypočte se aritmetický průměr pro každý analyt. V případě překročení kritického rozdílu mezi 2 po sobě jdoucími analýzami se provede třetí vyšetření.


 * {| class = wikitable


 * + Kritické rozdíly pro analyty lipidového metabolismu

! Analyt !! Kritický rozdíl [%]
 * align = center | Celkový cholesterol || align = center | > 20
 * align = center |LDL-cholesterol||align = center | > 25
 * align = center |HDL-cholesterol ||align = center | > 25
 * align = center |Triacylglyceroly||align = center |> 65
 * }
 * align = center |HDL-cholesterol ||align = center | > 25
 * align = center |Triacylglyceroly||align = center |> 65
 * }
 * }

Je třeba rovněž vzít v úvahu, že vyšetření lipidového metabolismu je významně ovlivněno životním stylem (dietní návyky, pohybová aktivita, tělesná hmotnost), farmakoterapií (hormonální antikoncepce, hormonální substituční léčba ad.) a probíhajícím akutním nebo nekompenzovaným onemocněním. Proto vyšetření krevních lipidů nemá být prováděno tehdy, kdy lze předpokládat, že výsledek nebude vypovídat o situaci za běžného životního stylu (krátce po dovolené, při hospitalizaci z jiných důvodů, akutním diabetes mellitus, v těhotenství a půl roku po něm atd.).

Princip
270px|thumb|Obr. 2 Stanovení celkového cholesterolu Cholesterol je v krevní plazmě transportován jako součást lipoproteinů, z největší části ve frakci LDL, méně v HDL a VLDL. Z tohoto cholesterolu jsou přibližně dvě třetiny esterifikovány vyššími mastnými kyselinami, zbytek je neesterifikován.
 * Běžně je v séru (plazmě) stanovován celkový cholesterol. Proto vlastnímu stanovení celkového cholesterolu předchází hydrolýza esterů cholesterolu na volný cholesterol a mastné kyseliny pomocí enzymu cholesterolesterázy (CE).
 * Následuje oxidace neesterifikovaného cholesterolu na 4-cholesten-3-on za současného vzniku peroxidu vodíku v reakci katalyzované cholesteroloxidázou (CHOD).
 * Poslední reakce využívá peroxidu vodíku k oxidační kopulaci 4-aminoantipyrinu a fenolu v přítomnosti dalšího enzymu peroxidázy (POD). Vzniká barevný produkt, jehož absorbance je úměrná množství cholesterolu (obr. 2).

Hodnocení

 * Se stoupající koncentrací celkového cholesterolu se zvyšuje riziko aterosklerózy. Podle českých a evropských doporučení má být koncentrace celkového cholesterolu < 5,0 mmol/l. Celkový cholesterol by měl být stanoven u všech osob nad 18 let v rámci prevence. Vyšetření by mělo být i v případě normálního výsledku t.j. do 5,0 mmol/l opakováno za 5 let.


 * Pokud je koncentrace vyšší a dále u nemocných s ischemickou chorobou srdeční a dalších rizikových osob, přistupujeme k podrobnějšímu vyšetření lipidového spektra stanovením LDL- a HDL cholesterolu a triacylglycerolů.


 * U pacientů se zvýšeným rizikem kardiovaskulárního onemocnění (např. diabetici) by celkový cholesterol měl být nižší < 4,5 mmol/l a u osob s již manifestním kardiovaskulárním onemocněním dokonce < 4,0 mmol/l.


 * Zvýšená koncentrace cholesterolu se dále často nachází u diabetiků nebo u hypotyreózy. Ke snížení koncentrace celkového cholesterolu dochází např. u pokročilých jaterních cirhóz nebo hypertyreózy nebo malnutrici.


 * Je markerem pro celkovou mortalitu a pro KVO rizikovým faktorem. Vztah cholesterolu k celkové mortalitě je nelineární, má tvar písmene J nebo U, který lze vysvětlit mechanismem reverzní kauzality.

Hodnoticí meze
Koncentrace celkového cholesterolu v séru (S-cholesterol celkový): 2,9–5,0 mmol/l.

Princip
Koncentraci LDL-cholesterolu lze zjistit nepřímo pomocí výpočtu nebo přímou analýzou.

Nepřímé stanovení LDL-C

 * Při nepřímém stanovení LDL-C se používá tzv. Friedewaldův vzorec.
 * LDL-cholesterol = celkový cholesterol – HDL-cholesterol – TG/2,2


 * Vychází z předpokladu, že cholesterol v séru je obsažen ve frakci HDL, LDL a VLDL. Výpočet vyžaduje měření tří různých analytů – celkového cholesterolu, HDL-cholesterolu a triacylglycerolů. Tím se zvyšuje možnost analytických chyb. Celkový cholesterol a HDL-cholesterol stanovujeme přímo. Zjištění cholesterolu ve VLDL je obtížné. Určujeme ho na základě předpokladu, že molární poměr cholesterolu ve VLDL činí průměrně 45 % obsahu celkových triacylglycerolů; potom zlomek TG/2,2 představuje cholesterol ve VLDL částicích. Vzorec lze použít pouze za předpokladu, že hodnota triacylglycerolů není vyšší než 4,5 mmol/l, nesmějí být přítomna chylomikra.

Přímé stanovení LDL-C
Do praxe se postupně zavádí přímé stanovení LDL-cholesterolu homogenními metodami bez nutnosti separačních kroků a centrifugace, jejichž výhodou je možnost automatizace. Zjednodušení analýzy bylo dosaženo použitím různých detergentů a dalších reagencií, které specificky blokují nebo rozpouštějí jednotlivé lipoproteinové frakce. Tímto způsobem se oddělí LDL částice, v nichž se v závěrečné fázi analýzy určí obsah cholesterolu. 270px|thumb|Obr. 3A Přímé stanovení LDL-cholesterolu 270px|thumb|Obr. 3B Přímé stanovení LDL-cholesterolu

Pro přímé stanovení LDL-C bylo vypracováno několik postupů. Analýza bývá rozdělena do dvou kroků.


 * Jeden z postupů využívá různých detergentů a dalších látek k selektivnímu zablokování cholesterolu v non-LDL částicích (HDL, VLDL a chylomikrony), jejichž cholesterol se stává nedostupným pro působení enzymů používaných k jeho stanovení. V neblokovaných LDL-částicích je po uvolnění stanoven cholesterol enzymovou metodou popsanou u celkového cholesterolu pomocí reakcí cholesterolesterázy, cholesteroloxidázy a peroxidázy (Obr. 3A).

Existují i další metody pro stanovení přímého LDL-cholesterolu.
 * V jiné metodě je v první fázi pomocí detergentu uvolněn cholesterol z chylomikronů, VLDL a HDL. Uvolněný cholesterol je přeměněn pomocí enzymů až na 4-cholesten-3-on a peroxid vodíku. Peroxid vodíku vzniklý v této fázi není využit k tvorbě barevného produktu, neboť by interferoval v dalším kroku stanovení. Proto je rozložen katalázou na vodu a kyslík. Při této reakci se nevyvíjí zbarvení.Ve druhé fázi jiný detergent uvolní cholesterol z LDL a ten je poté stanoven podobně jako u celkového cholesterolu (Obr. 3B).

Hodnocení

 * Zvýšená koncentrace LDL-cholesterolu se významně podílí na rozvoji aterosklerózy. Doporučená koncentrace LDL-cholesterolu je podle současných českých a evropských doporučení < 3,0 mmol/l.
 * Pro pacienty se zvýšeným rizikem kardiovaskulárního onemocnění jsou doporučovány koncentrace LDL < 2,6 mmol/l a pro pacienty s již rozvinutým kardiovaskulárním onemocněním < 1,8 mmol/l.

Hodnoticí meze
LDL-cholesterol v séru: 1,2–3,0 mmol/l

Princip
Starší metody pro stanovení HDL-C

Starší metody využívají postupy založené na stanovení cholesterolu v HDL částicích po odstranění non-HDL částic. Vysrážené lipoproteinové částice jsou odděleny centrifugací. V supernatantu je poté stanovena koncentrace cholesterolu v HDL částicích pomocí běžně používaných fotometrických metod.

Přímé stanovení HDL-C
Moderní snadno automatizovatelné metody využívají podobně jako je tomu u LDL-C přímého stanovení HDL-cholesterolu pomocí homogenních metod bez precipitace a centrifugace. Pro přímé stanovení HDL-C bylo vypracováno několik postupů. Analýza bývá rozdělena do dvou kroků.

270px|thumb|Obr.4A Přímé stanovení HDL-cholesterolu imunoinhibicí 270px|thumb|Obr.4B Přímé stanovení HDL-cholesterolu


 * V prvním kroku jsou blokovány všechny non-HDL částice (VLDL, LDL, chylomikrony). Zablokováním non-HDL částic se znemožní reakce v nich obsaženého cholesterolu s enzymy používanými k jeho stanovení. Blokace může být dosaženo imunoinhibicí pomocí protilátek namířených proti apoB, který je součástí VLDL, LDL i chylomikronů. Protilátky vytvářejí s non-HDL rozpustné imunokomplexy. V dalším kroku detergent rozpustí HDL částice a pomocí enzymů cholesterolesterázy, cholesteroloxidázy a peroxidázy je měřen cholesterol v HDL stejným způsobem jako při stanovení celkového cholesterolu, tj. pomocí enzymů (obr. 4A).


 * Další metoda používá k blokaci polyaniontů a polymerů, které se selektivně adsorbují na povrch non-HDL lipoproteinům. Ty jsou potom chráněny vůči detergentům, které uvolňují cholesterol obsažený pouze v HDL částicích. Druhý krok analýzy je analogický postupu popsanému u první metody (obr. 4B).

Hodnocení

 * Koncentrace HDL-cholesterolu by měly být > 1,0 mmol/l u mužů a > 1,2 mmol/l u žen. Zvýšený HDL-C je považován za „negativní rizikový“ faktor rozvoje aterosklerózy a naopak hladiny nižší než 1,0 mmol/l jsou spojovány se zvýšeným rizikem aterosklerózy.
 * Nízký HDL provází metabolický syndrom, nízkou tělesnou aktivitu, DM 2.typu, kuřáctví cigaret a konzumaci velkého množství sacharidů.

Hodnoticí meze

 * HDL-cholesterol v séru (muži): 1,0–2,1 mmol/l


 * HDL-cholesterol v séru (ženy): 1,2–2,7 mmol/l

Stanovení triacylglycerolů
270px|thumb|Obr.5 Stanovení triacylglycerolů

Princip
Doporučené rutinní metody stanovení triacylglycerolů využívají několika enzymových reakcí.


 * Lipoproteinová lipáza katalyzuje hydrolýzu triacylglycerolů na glycerol a mastné kyseliny.
 * Uvolněný glycerol se převádí působením glycerolkinázy v přítomnosti ATP na glycerol-3-fosfát, který je pomocí glycerol-3-fosfátoxidázy oxidován na dihydroxyacetonfosfát.
 * Současně vzniklý peroxid vodíku je využíván v další reakci katalyzované peroxidázou k oxidační kopulaci 4-aminoantipyrinu s derivátem fenolu. Vzniká chinoniminové barvivo, jehož absorbance se odečítá.

Hodnocení

 * Zvýšená koncentrace triacylglycerolů je nezávislým rizikovým faktorem aterosklerózy. Česká a evropská doporučení považují za normální koncentraci triacylglycerolů v séru hodnotu < 1,7 mmol/l.
 * Koncentrace TG > 1,7 mmol/l (nalačno) je považována za ukazatel zvýšeného kardiovaskulárního rizika. Vyšší triacylglyceroly bývají spojené se sníženými hladinami HDL a předpovídají vysoké koncentrace remnantů bohatých na cholesterol a malých hustých částic LDL typu B.
 * Koncentrace triacylglycerolů se zvyšuje během 2 hodin po jídle a maxima dosahuje za 4–6 hodin, proto musí být krev na stanovení triacylglycerolů odebírána po 12–14 hodinovém lačnění. Vzorky plazmy s koncentrací TG vyšší než 3,4 mmol/l opaleskují, při hladinách TG nad 11,3 mmol/l jsou přítomny chylomikrony a plazma je mléčně zakalená.
 * Při terapii se klade velký důraz na dietu s nízkým obsahem tuků a cukrů, na zvýšenou tělesnou aktivitu, dostatek antioxidantů v potravě a na celkovou hypolipidemickou léčbu.

Hodnoticí meze
Koncentrace triacylglycerolů v séru (fS-triacylglyceroly): 0,45–1,7 mmol/l

Odvozené parametry lipidového metabolismu
Cílem těchto výpočtů je zpřesnit stanovení rizika, které vyplývá z naměřených hodnot krevních lipidů.

Aterogenní index

 * Z naměřených hodnot týkajících se cholesterolu lze počítat různé aterogenní indexy. Doručován je index, který bere v úvahu vliv koncentrace celkového cholesterolu i HDL-C na riziko kardiovaskulárních onemocnění. Index zohledňuje fakt, že zvýšený HDL-C je „negativní rizikový faktor“, snižující riziko ischemické choroby srdeční (ICHS). Současné zvýšení celkového i HDL cholesterolu nemusí riziko ICHS zvyšovat.


 * Celkový cholesterol/HDL-cholesterol

Doporučená hodnota
Aterogenní index: < 5,0

Non-HDL-cholesterol

 * Je využíván k odhadu rizika aterosklerózy v případech, kdy není možno vypočítat koncentraci LDL-C. Představuje cholesterol obsažený v potenciálně aterogenních lipoproteinových částicích (LDL, IDL, VLDL, zbytkové chylomikrony).
 * Non-HDL-cholesterol (mmol/l) = celkový cholesterol (mmol/l) – HDL-cholesterol (mmol/l)

Doporučená hodnota
Non-HDL-cholesterol: < 3,8 mmol/l

Chylomikronový test
Princip: thumb|250px|Obr. 6 Vzhled séra při chylomikronovém testu
 * Měření koncentrace chylomikronů není běžně prováděno. Ve vzorcích odebraných po 12 hodinovém lačnění by se neměly vyskytovat. Pro jejich přítomnost svědčí silná chylozita séra. K důkazu lze provést chylomikronový test, který spočívá v pozorování opalescentního až bílého prstence po 12ti hodinovém stání séra při 4 °C. Během této doby flotují eventuálně přítomné chylomikrony k hladině vzorku. Každé zdravé sérum má být po 12 hodinovém lačnění úplně čiré.
 * Vzhled séra při chylomikronovém testu může upozornit i na jiné poruchy v metabolismu lipoproteinů.

Princip

 * Lipoproteinové částice se dělí v elektrickém poli podle rozdílné velikosti povrchového náboje, v tomto případě podmíněného rozdílným množstvím bílkovin v jednotlivých frakcích. Využívá se především pro průkaz některých abnormálních lipoproteinů a při diagnostice méně častých typů hyperlipoproteinémií a pro detekci aterogenního lipoproteinu Lp (a).
 * Nejrychleji v oblasti &alpha; se pohybují nejmenší částice s nejvyšším obsahem proteinů &alpha;-lipoproteiny (HDL). Na úrovni mezi &alpha;-2 a &beta; jako pre-&beta;-lipoproteiny migrují VLDL částice. LDL částice představují obvykle nejvýraznější frakci jako &beta;-lipoproteiny v oblasti &beta;-globulinů. Chylomikrony, pokud jsou přítomny v séru, zůstávají na startu, někdy mohou vytvářet pruh, který je viditelný od místa startu až k &alpha; oblasti. V poloze mezi &alpha; a &beta;-lipoproteiny (HDL a LDL) se může objevit další frakce charakteristická pro lipoprotein (a) – Lp(a), který představuje rizikový faktor pro vznik aterosklerózy a kardiovaskulárních onemocnění.
 * Provedení elektroforézy sérových lipoproteinů je obdobné jako u elektroforézy sérových bílkovin s tím rozdílem, že k barvení se používají lipofilní barviva např. Sudanová čerň. Elektroforéza lipoproteinů se obvykle provádí na agarosovém gelu, který umožňuje dobré oddělení pre-&beta;-lipoproteinů.

Hodnocení

 * Elektroforeogram lze vyhodnotit denzitometricky při vlnové délce 580 nm. Výsledek se vyjadřuje v procentech optické hustoty pro jednotlivé frakce vzhledem k celkové barevné ploše. Stanovené hodnoty spolu s dalšími ukazateli (celkový cholesterol, triacylglyceroly) slouží k charakterizaci hyperlipoproteinémií (Obr. 7, 8, 9).


 * V praxi se provádí také hodnocení pouze vizuální. Biologický nález se srovnává s referenčními hodnotami a výsledek se posuzuje ve smyslu zvýšení (snížení) jednotlivých frakcí.

Související články

 * Dyslipidémie
 * Lipoproteiny (klinika)
 * Lipoproteiny
 * Hypolipidemika
 * Hypolipidemická léčba

Externí odkazy

 * Lipoproteiny (česká wikipedie)
 * Lipoprotein (anglická wikipedie)